多特異性受體的改進的純化的制作方法
【專利說明】多特異性受體的改進的純化
[0001] 本申請是申請日為2010年09月16日，申請號為201080041158. 3,發明名稱為"多 特異性受體的改進的純化"的申請的分案申請。 發明領域
[0002] 本發明涉及復合受體，即能夠結合癥狀引發分子例如氨基酸或碳水化合物上的多 個結構的受體的純化領域。本發明還涉及治療數種代謝紊亂的方法，在這些代謝紊亂中來 源于普通膳食的生物分子在患者體內引發疾病癥狀。
[0003] 發明背景
[0004] 親和層析是利用層析基質上的分子與該分子的結合配偶體之間的相互作用以從 與該分子具有不同親和力的物質的更大池中或從粗混合物例如發酵儲液中選擇結合配偶 體亞群的方法。
[0005] 利用分子之間的結合以用于純化、分析、診斷等目的的方法，例如親和層析，受到 由層析基質上的分子的取向導致的位阻和受到其與基質偶合的方式（經由載體分子、間隔 物、接頭等）的固有限制。這種限制的后果是僅分子總集的有限部分的不連續結合位點暴 露于受體一用于與基質偶合的那些位點不能靠近與被包被的層析基質處于接觸狀態的結 合配偶體。
[0006] 在許多情況中，由于感興趣的是結合配偶體的單獨一個特定結合特征，這不存在 問題。
[0007]當開發受體時，無論是所謂的天然受體例如抗體，或合成受體例如分子印跡聚合 物（MIP)，可溶或不溶的最佳結合單獨受體實體一抗體分子或MIP顆粒的選擇/分離是提高 所得的基于受體的產品的親和力、特異性、容量等的手段一關于MIP，參考WO 2007/095949 其中公開了純化方法，該純化方法產生具有提高的對靶分子的結合親和力和容量的MIP組 合物。
[0008] 然而，存在對進一步提高組合物例如MIP和多克隆抗體的結合特性的需要。
[0009] 發明概述
[0010] 當制備祀分子的受體組合物時，與祀分子結合的親和力或親合力（avidity)取決 于幾個因素。相對大的受體分子例如多克隆抗體和MIP與較小的靶在該靶上的幾個不同 的不連續位點（discrete site)上結合且將革El分子用作層析基質上的捕獲劑，其中經由一 個特定的官能團連接靶分子的純化方法將具有的結果是純化產物不必要結合那個官能團 (因為其在與基質偶合之后是結合不可及的）。另一方面，這些多位點結合受體的獨特性質 是第一輪純化之后獲得的分子將包括至少部分地結合第一輪純化不可及的位點的受體。所 以，如果技術人員設計使用相同靶分子作為捕獲劑，但經由不同的官能團結合的另外步驟， 進一步富集對第一純化步驟中的"隱藏結合位點"也顯示出適度高特異性的那些受體應該 是可能的。
[0011] 富集與期望靶分子的"特有"部分結合的受體也將是可能的一對于其中官能團經 由其與基質的結合而隱藏的每一純化步驟，將在純化程序期間排除其結合依賴隱藏官能團 的受體一因此，如果靶分子包括與許多其他分子（如氨基酸的情形，其中每一種氨基酸都 具有在氨基酸之間結構上相同的N端和C端）共有的非特有官能團，其中每一種非特有官 能團依次被隱藏的多步純化程序將提供與靶分子真正特有的官能團結合的受體組合物。
[0012] 因此，第一方面本發明涉及制備富集與因子（agent)結合的受體的組合物的方 法，其中所述受體各自特異性結合所述因子上的至少兩個不連續位點，所述方法包括：
[0013] a.提供包含所述受體的樣品，
[0014] b.對所述樣品進行第一親和層析步驟，其中所述因子用作親和純化劑，且其中經 由與所述至少兩個不連續位點的單個位點結合將所述因子固定在固相或半固相上，
[0015] c.回收與所述因子結合的受體，
[0016] d.對前述步驟中回收的受體進行至少一個另外的親和層析步驟，其中所述因子用 作親和純化劑，且其中經由與所述至少兩個不連續位點的另一個位點結合將所述因子固定 在固相或半固相上，并回收與所述因子結合的受體，
[0017] 其中，在每一個所述至少一個另外的親和層析步驟中，所述至少兩個不連續位點 的所述另一個位點與已用于前述步驟b和d中將所述因子固定在固相或半固相上的所述至 少兩個不連續位點的任何一個位點不同。
[0018] 在一些實施方案中，所述受體可選自由分子印跡聚合物（MIP)和多克隆抗體組成 的組。
[0019] 在一些實施方案中，所述受體可選自可溶性MIP或不溶性MIP。
[0020] 在一些實施方案中，所述受體可以為不溶性MIP。
[0021 ] 在一些實施方案中，所述受體可以為可溶性MIP。
[0022] 在一些實施方案中，所述受體可以為單特異性多克隆抗體。
[0023] 在一些實施方案中，所述親和層析可包括使用流化床系統，例如膨脹床系統。
[0024] 在一些實施方案中，所述因子可以是具有式H3N+-CH(R)-COO的化學物質，例如氨 基酸或具有至多5個氨基酸殘基的肽。
[0025] 在一些實施方案中，所述氨基酸可選自苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨 酸、異亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸。
[0026] 在一些實施方案中，所述肽在其序列中可包括選自由苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、 亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸組成的組的至少一種氨基 酸。
[0027] 在一些實施方案中，所述肽在N端、在C端或在兩端可具有選自由苯丙氨酸、酪氨 酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸組成的組的氨基 酸。
[0028] 在一些實施方案中，所述肽可以為二肽、三肽、四肽或五肽。
[0029] 在一些實施方案中，所述因子可以是碳水化合物。
[0030] 在一些實施方案中，所述碳水化合物可以是具有最多10個單糖單元的支鏈或線 性低聚糖。
[0031 ] 在一些實施方案中，所述碳水化合物可選自單糖、二糖和三糖。
[0032] 在一些實施方案中，所述碳水化合物可選自D-半乳糖和乳糖。
[0033] 在一些實施方案中，所述因子可以是脂肪酸或脂質。
[0034] 在一些實施方案中，所述因子可以是選自由膽固醇、甘油三酯、和膽汁酸或其鹽組 成的組的脂質。
[0035] 在一些實施方案中，所述因子可以是寡核苷酸或寡核苷酸衍生物。
[0036] 在一些實施方案中，所述寡核苷酸或寡核苷酸衍生物可選自由RNA寡核苷酸、DNA 寡核苷酸、LNA寡核苷酸、PNA寡核苷酸和混合寡核苷酸組成的組。
[0037] 在一些實施方案中，所述寡核苷酸可以是混合寡核苷酸，所述混合寡核苷酸包括 至少一個核糖核苷酸單元或脫氧核糖核苷酸單元和至少一個LNA核苷酸單元或PNA核苷酸 單元。
[0038] 第二方面，本發明涉及制備富集與因子結合的受體的組合物的方法，其中所述受 體各自特異性結合所述因子上的至少兩個不連續位點，所述方法包括按照本發明第一方面 的方法制備至少兩種組合物并隨后組合所述至少兩種組合物以獲得富集與所述因子結合 的受體的組合物，其中在制備所述至少兩種組合物中的步驟b和d中使用相同因子，且其 中：
[0039] i .對于至少兩種組合物，用于固定到固相或半固相上以制備所述至少兩種組合 物的每一種的所述因子中的不連續位點的組合不同，和/或
[0040] ii .在制備所述至少兩種組合物的至少兩種的過程中，用于固定到固相或半 固相上以制備所述至少兩種組合物的每一種的所述因子中的不連續位點的使用順序 (sequential order)不同。
[0041] 在一些實施方案中，當制備所述至少兩種組合物的每一種時所述因子中的相同不 連續位點可用于固定，其中所述至少兩種組合物的數目等于所述至少兩個不連續位點的數 目，且其中對于所述至少兩種組合物的每一種來講，用于固定到固相或半固相上以制備所 述至少兩種組合物的每一種的所述不連續位點的使用順序可以是唯一的。
[0042] 在一些實施方案中，所述不連續位點的數目可以為2或3。
[0043] 第三方面，本發明涉及治療、改