一種明膠親和層析介質的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種明膠親和層析介質的制備方法及其應 用。
【背景技術】
[0002] 纖維連接蛋白（簡稱FN)廣泛分布于細胞表面和血漿中，其中血漿型的纖維連接 蛋白存在于血漿和體液中，具可溶性。大量國內外的研宄結果證明，纖維連結蛋白在進化 過程中保守性很強，各種動物的纖維連接蛋白具有非常相近的結構、性質和生物學功能，因 而不同來源的FN可以相互替代使用。由于血漿纖維連接蛋白濃度增高常見于急性和慢 性肝炎、脂肪肝、肝硬化、阻塞性黃疸、腦血管病變、妊娠晚期、妊高癥、胰腺癌、肺癌、癌性腹 水、腺癌廣泛轉移等，濃度降低常見于急性白血病、彌散性血管內凝血（簡稱DIC)、暴發性 肝衰竭、燒傷、創傷、休克、細菌性或病毒性感染、急性呼吸窘迫綜合癥、糖尿病并發酮癥酸 中毒、尿毒癥、急性循環衰竭、絕經期婦女以及部分化療耐受差的患者。所以纖維連接蛋白 主要應用于細胞培養、傷口修復和愈合、癌癥的診斷和治療、治療血液系統和心腦血管系統 疾病、修復并加速愈合宮頸糜爛異常細胞、敗血癥和休克等急救的輔助治療。目前國內纖維 連接蛋白市場幾乎全部被國外產品所占領，國內現在還處在早期的研宄及分離純化工藝的 開發，在工藝的優化設計中，層析介質也幾乎全部被國外產品所占領，而層析介質的選擇決 定了整個產品的質量和規模化生產的進度。
[0003] 現有制備技術是通過微囊發生器-靜電法、離子凝聚法和三次凍干法制得三維多 孔殼聚糖/明膠微球，主要步驟為：將1. 5%殼聚糖乙酸溶液和2%明膠B水溶液按體積比， 吸入安裝在便攜式微量注射泵上的注射器中，注射器針頭末端連接高壓脈沖微膠囊成型儀 的正極，針頭下方的金屬導線環連接高壓脈沖微膠囊成型儀的負極，導線環下方為液氮罐， 依次打開高壓脈沖微膠囊成型儀、便攜式微量注射泵開關，在高壓靜電作用下使得形成的 液滴滴入液氮中快速冷凍成球，成球后再進行凍干，控制凍干溫度為_60°C至_80°C，凍干 24-48h后得到一次凍干的殼聚糖/明膠微球1 ;將微球1用含有飽和三聚磷酸鹽（TPP) 85% 的乙醇溶液，控制體系pH值在5-6,交聯固化24-72h后，終止交聯反應，放入-20 °C冰箱過 夜，次日上凍干機，控制凍干溫度為_60°C至_80°C，凍干24-48h后得到二次凍干的微球2 ; 將微球2充分水化，加入2%水溶性交聯劑碳二亞胺/N-羥基琥珀酰（EDC/NHS)和2%明膠 A，在38°C水浴、避光反應24-48h后，洗去未反應EDC/NHS和明膠A，放入-20°C冰箱過夜，次 日進行第三次凍干，控制凍干溫度為_60°C至_80°C凍干24-48h后即得到三維多孔殼聚糖 /明膠微球3。（彭承宏，黃芳，韓寶三，吳旭波，董亞東，崔龍.一種三維多孔殼聚糖/明膠 微球及其制備方法和在肝細胞培養中的應用[P].中國專利：201110025674,2011-01-24)
[0004] 現有分離純化技術是通過鹽析沉淀，再過親和層析柱分離純化FN，最后過分子篩 層析柱脫鹽，超濾濃縮，冷凍干燥得到FN成品，主要過程為：采集新鮮動物血，加入檸檬酸 三鈉抗凝，迅速離心，分別收集血漿和血球，貯存于l〇°C以下環境中；向血漿中加硫酸銨至 飽和度20-30%，靜置1小時以上，過濾，取沉淀物溶解；上親和層析柱，提取分離出FN主峰 液；再經分子篩純化，超濾濃縮，除菌，最后冷凍干燥，得到FN產品。（王德亮.動物血纖維 連接蛋白聯產工藝[P]?中國專利：200510017717,2005-06-22)
[0005] 現有制備技術的缺點為該制備方法分三步凍干，反應和清洗過程均繁瑣復雜，時 間過長；所需生產設備過多且昂貴，嚴重增加了生產成本；對設備及過程控制較為嚴格，只 適合實驗室級別制備，不易放大至生產線規模生產；產品的圓度較差，粒徑和孔徑過大，生 產過程中過低的溫度會導致產品的質量不穩定和重復性不高等。
[0006] 現有分離純化技術的缺點為分離純化步驟過多，耗時過長，纖維連接蛋白活性偏 低，蛋白濃度和純度過低。
【發明內容】
[0007] 鑒于現有技術所存在的問題，本發明提供一種明膠親和層析介質的制備方法，并 利用制備的明膠親和層析介質來分離純化纖維連接蛋白，具有純化效率高、生產周期短、工 藝簡單等優點。
[0008] 本發明解決上述技術問題的技術方案如下：
[0009] 一種明膠親和層析介質的制備方法，包括以下步驟：
[0010] 1)利用激活液清洗CNBr-瓊脂糖親和層析介質（優選地，激活液的體積為 CNBr-瓊脂糖親和層析介質的體積的5-10倍），去除激活液；再用結合液清洗CNBr-瓊脂糖 親和層析介質（優選地，結合液的體積為CNBr-瓊脂糖親和層析介質的體積的5-10倍），去 除結合液，得到已激活的CNBr-瓊脂糖親和層析介質；所述激活液為HCl溶液或NaCl-HCl 溶液，pH為2. 0-4. 5 ;所述結合液為NaCl-NaHCO3溶液，pH為7. 0-8. 6 ;
[0011] 2)利用結合液配制明膠的濃度為5-20mg/mL的明膠溶液（其中溶質為明膠，溶劑 為步驟1)所述的結合液），混勻；
[0012] 3)向步驟2)得到的明膠溶液中加入等體積的步驟1)中已激活的CNBr-瓊脂糖親 和層析介質，4-35°C條件下攪拌偶聯1-24小時；
[0013] 4)偶聯完畢，過濾，得到濾液和已偶聯的明膠親和層析介質；檢測并計算CNBr-瓊 脂糖親和層析介質結合明膠的濃度；
[0014] 5)將步驟4)得到的已偶聯的明膠親和層析介質抽干，用封閉液清洗（優選地，封 閉液的體積是已偶聯的明膠親和層析介質的體積的3-5倍），所述封閉液為HO(CH 2)2順2或 pH 為 7. 0-8. 6 的 0? OOl-L Omol/L Tris 溶液（優選地，pH 為 7. 0-8. 6 的 0? OOl-L Omol/L Tris-HCl溶液），去除封閉液后，并加入等體積的封閉液控溫（4-35°C條件下）慢速（轉速 為100-200rpm)攪拌封閉（時間為3-18h)，得到封閉液處理后的明膠親和層析介質；
[0015] 6)將步驟5)得到的封閉液處理后的明膠親和層析介質抽干，利用酸清洗液和堿 清洗液交替清洗，再用水清洗，加入乙醇溶液，保存，得到明膠親和層析介質；所述堿清洗液 為NaCl-Tris溶液，pH為7. 0-8. 6 ;所述酸清洗液為NaCl-NaAc溶液，pH為2. 0-4. 5。
[0016] 本發明的有益效果是：
[0017] 本發明中明膠親和層析介質與一般的親和層析介質相比（例如三維多孔殼聚糖/ 明膠微球）具有以下優勢：
[0018] 1、提高了明膠親和層析介質的圓度，降低了粒徑和孔徑，本發明制備的明膠親和 層析介質的粒徑為45-165微米、孔徑為0. 003-0. 9微米，而現有技術中的親和層析介質的 粒徑為300-800微米、孔徑為50-200微米；由于分辨率是由孔徑大小決定的，孔徑越小，分 辨率越高，從而本發明所述的明膠親和層析介質可以顯著提高分辨率和純化效率；
[0019] 2、針對現有的制備技術中存在的問題（例如：制備方法需要分三步凍干，反應和 清洗過程均繁瑣復雜，時間過長），本發明所述明膠親和層析介質的制備只需要一步反應和 一步封閉，反應過程操作簡單、易于控制、品質穩定，生產周期大大縮短至24小時內；
[0020] 3、針對現有技術中所需生產設備過多且昂貴，嚴重增加了生產成本（例如現有技 術種使用的主要設備為：高壓脈沖微膠囊成型儀30000元/臺左右、便攜式微量注射泵 3000元/臺左右、真空冷凍干燥機100000元/臺左右、冷凍冰箱5000元/臺左右）；本發 明所述的明膠親和層析介質的制備過程中所需設備更少更便宜，大大降低了生產成本，更 適合大規模生產。
[0021] 在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。
[0022] 進一步，所述激活液含有0-0? 5mol/L NaCl和0? 001-0. lmol/L HC1，所述激活液的 pH為 2. 0-4. 5。
[0023] 采用上述進一步方案的有益效果是：pH為2. 0-4. 5可以保證配基的激活最高，激 活液含有0-0?5mol/L NaCl和0? 001-0.lmol/L HCl可以保證在后續步驟中CNBr-瓊脂糖 親和層析介質與明膠中的蛋白質的結合量最高。
[0024] 進一步，所述結合液含有 0? 001-0. 5mol/L NaCl 和 0? 001-0. 5mol/L NaHCO3，所述 結合液的pH為7. 0-8. 6。
[0025] 采用上述進一步方案的有益效果是：采用上述pH和濃度可以保證在后續步驟中 CNBr-瓊脂糖親和層析介質與明膠中的蛋白質的結合量最高。
[0026]進一步，所述封閉液為 HO (CH2) 2順2或 pH 為 7.0-8.6 的0?lmol/L Tris-HCl。
[0027] 采用上述進一步方案的有益效果是：采用上述的pH和濃度可以保證封閉明膠中 的蛋白質的效果最好。
[0028] 進一步，所述堿清洗液含有 0? 001-0. 5mol/L NaCl 和 0? 001-0. 5mol/L Tris，所 述堿清洗液pH為7. 0-8. 6 ;所述酸清洗液含有0? 001-0. 5mol/L NaCl和0? 001-0. 5mol/L NaAc，所述酸清洗液的pH為2. 0-4. 5。
[0029] 采用上述進一步方案的有益效果是：采用上述pH和濃度可以保證制備的明膠親 和層析介質的適用穩定性和重復性。
[0030] 進一步，所述激活液、結合液、封閉液、酸清洗液、堿清洗液均為預冷溶液，預冷溶 液的溫度為4-8°C ;步驟6)的水為預冷的水，預冷的水的溫度范圍為4-8°C，所述保存的溫 度為4-8°C。
[0031] 采用上述進一步方案的有益效果是：可以保證即使在長時間的操作下，也能夠保 持明膠中的蛋白質的活性不受溫度的影響而變性。
[0032] 本發明中，HO(CH2)2NH2的中文名稱為2-羥基乙胺，為液體，質量分數為100%。
[0033] 本發明所述的明膠親和層析介質的制備過程中：
[0034] 步驟1)將CNBr-瓊脂糖親和層析介質上活化的氰酸酯基團進行水解，從而激活 CNBr-瓊脂糖親和層析介質；
[0035] 步驟2)溶解明膠，便于明膠中的基團與CNBr-瓊脂糖親和層析介質上的基團進行 連接反應；
[0036] 步驟3)將CNBr-瓊脂糖親和層析介質與明膠偶聯，將CNBr-瓊脂糖親和層析介質 上水解活化的基團與明膠中的伯胺基團或相似的親和基團反應形成異脲連接物；
[0037] 步驟4)CNBr_瓊脂糖親和層析介質與明膠結合濃度檢測，中間過程質量控制，實 時監測并控制CNBr-瓊脂糖親和層析介質與明膠的結合濃度；
[0038] 步驟5)封閉，增加CNBr-瓊脂糖親和層析介質與明膠中的蛋白質的結合作用，防 止明膠中的蛋白質在其他條件下與CNBr-瓊脂糖親和層析介質分離；
[0039] 步驟6)明膠親和介質清洗，使明膠親和介質具有更好的穩定性和重復性。
[0040] 本發明所述的明膠親和層析介質的制備方法中，在步驟4)過濾后，可以通過檢測 濾液在UV280處的吸光度值，根據測定明膠的標準曲線計算出慮液中的明膠濃度，最終計 算出CNBr-瓊脂糖親和層析介質結合明膠的濃度。
[0041] 利用上述方法制備的明膠親和層析介質可以用于蛋白質的分離和純化，尤其是纖 維連接蛋白的分離和純化。
[0042] 一種利用上述方法制備的明膠親和層析介質分離純化纖維連接蛋白的方法，包括 以下步驟：
[0043] 1)將制備的明膠親和層析介質用水清洗（優選地，水的體積是明膠親和層析介質 的體積的5-10倍），去除水；再用平衡液清洗（優選地，平衡液的體積是明膠親和層析介質 的體積的3-5倍），去除平衡液；之后，向明膠親和層析介質中加入平衡液，混勻后裝入層析 柱中，直至柱面無變化；所述平衡液為〇? 001-0. 5mol/L Na2HP04、0. 001-0. 5mol/L KH2P04、 0? 001-0. 5mol/L KC1、0. 001-0. 5mol/L NaCl 的混合液，所述平衡液的 pH 為 7. 0-8. 6 ; [0044] 2)打開蛋白純化系統，打開檢測器預熱，清洗管路并將步驟1)中的層析柱與蛋白 純化系統連接，設置參數，用5-10倍體積（指層析柱中明膠親和層析介質的柱體積）的平 衡液以恒速平衡層析柱至各參數不變IOmin以上，調零；
[0045] 3)將待分離純化纖維連接蛋白的樣品恒速流過裝有明膠親和層析介質的層析柱， 分管收集樣品流穿峰，利用蛋白電泳檢測收集的樣品；
[0046] 4)利用平衡液恒速清洗裝有明膠親和層析介質的層析柱（優選地，所述平衡液的 體積是層析柱中