殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾衍生物的合成及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水體和食品級之中痕量有機(jī)物分析領(lǐng)域，涉及到特異性吸附微囊藻毒素的殼聚糖改性材料的制備及使用方法，具體涉及一種殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾衍生物的合成及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國現(xiàn)代化進(jìn)程加快，由地表水富營養(yǎng)化引起的有害藍(lán)藻水華經(jīng)常性大范圍發(fā)生，其中藍(lán)藻水華中以微囊藻(Microcystis)水華發(fā)生最為普遍，所產(chǎn)生的微囊藻毒素不僅嚴(yán)重危害淡水水體，在淡水生態(tài)環(huán)境的食物鏈中，含有微囊藻毒素的藻體細(xì)胞被浮游動(dòng)物、甲殼類、貝類等攝食，通過動(dòng)物攝食而富集于多種魚類等水產(chǎn)品和禽類肉制品中，可以造成人類和禽畜多臟器損傷甚至引發(fā)癌癥。
[0003]由于微囊藻毒素(MC-LR)濃度在水體和食品樣品中較低，在檢測前需要進(jìn)行樣品的富集再進(jìn)行分析。目前純化富集微囊藻毒素的方法包括免疫親和柱、C18固定相、甲基丙烯酸丁酯毛細(xì)管、分子印跡聚合物、活性炭纖維和大孔樹脂等。但在這些方法中要么耗時(shí)長、對技術(shù)操作要求高，要么價(jià)格昂貴、對藻毒素的吸附量低，要么對微囊藻毒素的專一性不高，導(dǎo)致富集純化的微囊藻毒素的純度不高。因此目前需要一種廉價(jià)、專一性強(qiáng)和吸附量高的富集純化微囊藻毒素的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明根據(jù)微囊藻毒素(MC-LR)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，針對MC-LR結(jié)構(gòu)中含有疏水的苯環(huán)結(jié)構(gòu)和帶正電荷精氨酸的胍基，理論上疏水的苯環(huán)結(jié)構(gòu)可以和環(huán)糊精的疏水空腔進(jìn)行主體-客體反應(yīng)而特異性結(jié)合，帶正電荷精氨酸的胍基可以與帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)發(fā)生靜電作用和形成氫鍵并特異性結(jié)合，通過兩個(gè)化學(xué)鍵的特異性結(jié)合，可以提高材料對MC-LR結(jié)合專一性。
[0005]殼聚糖具有生物可降解性，無毒性，生物相容性好和低成本的優(yōu)點(diǎn)，主要應(yīng)用在醫(yī)藥、食品和環(huán)保等領(lǐng)域。殼聚糖上有許多羥基和氨基基團(tuán)，因此能夠參與許多殼聚糖的修飾反應(yīng)，固載環(huán)糊精的殼聚糖具有環(huán)糊精對有機(jī)物和金屬離子的包絡(luò)作用，近年來應(yīng)用化學(xué)修飾的方法來合成具有新的生物功能的殼聚糖衍生物，由于新基團(tuán)的引入而使其具有新的功能。
[0006]本發(fā)明選用了殼聚糖作為載體，進(jìn)行環(huán)糊精的固載，并進(jìn)行磷酸化修飾，合成殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化修飾的衍生物(CTS-⑶-P)，該衍生物通過殼聚糖上的環(huán)糊精和巰基磷酸特異性結(jié)合微囊藻毒素，提高了 MC-LR的富集效率，建立殼聚糖雙修飾衍生物對微囊藻毒素的吸附及其洗脫方法，旨在開發(fā)一種廉價(jià)、專一性強(qiáng)和吸附量高的富集純化微囊藻毒素的新型材料及其應(yīng)用方法。
[0007]本發(fā)明提供的殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾衍生物的合成方法，包括如下步驟: 取殼聚糖固載環(huán)糊精溶于甲烷磺酸中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入P2O5，于冰浴下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，加入乙醚以沉淀產(chǎn)物，即得殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾衍生物。
[0008]作為優(yōu)選技術(shù)方案，殼聚糖固載環(huán)糊精、甲烷磺酸與P2O5的比例為Ig:7-12 mL:l-5go
[0009]作為優(yōu)選技術(shù)方案，殼聚糖固載環(huán)糊精、甲烷磺酸與P2O5的重量比為lg: 10 mL:5
g°
[0010]作為優(yōu)選技術(shù)方案，上述合成方法于冰浴攪拌下反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為1~3小時(shí)。
[0011]作為優(yōu)選技術(shù)方案，上述的合成方法還包括，將得到的沉淀產(chǎn)物洗滌的步驟，沉淀產(chǎn)物依次以乙醚、丙酮、甲醇和乙醚洗滌。
[0012]作為優(yōu)選技術(shù)方案，殼聚糖固載環(huán)糊精通過如下方法制備:
殼聚糖溶解于體積濃度為1%的冰醋酸中，將溶解有單-6-對甲苯磺酰-β -環(huán)糊精的N, N- 二甲基甲酰胺加入其中，混合均勻，該混合體系在80-100°C下冷凝回流40-60小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用透析袋透析混合液3-4天，來純化目標(biāo)產(chǎn)物，接著冷凍干燥，得到棉花狀的固體，即為殼聚糖固載環(huán)糊精。
[0013]上述單_(對甲苯基磺酰基)β -環(huán)糊精通過如下方法制備:
I)稱取I份的β-環(huán)糊精加入8份水中，將含有堿的蒸餾水緩慢加入到β-CD(環(huán)糊精)的懸浮液中，堿為NaOH，KOH或氨水，一邊滴加一邊攪拌，滴加時(shí)間為8~10min，最后β -⑶完全溶于堿中，懸浮液變成透明的β -CD溶液。
[0014]將I份的對甲基苯磺酰氯溶解到3份的有機(jī)溶劑中，有機(jī)溶劑為丙酮，乙腈，三氯甲烷，然后逐漸滴到透明的β-CD溶液中，一邊滴加一邊用玻璃棒攪拌，滴加時(shí)間為10~12mino滴加結(jié)束后，透明的⑶溶液變成渾濁液。恒溫磁力攪拌器18_22°C下100r/min攪拌2.5h。反應(yīng)結(jié)束后離心分離得到上清液，將上清液于4°C里放置半天，會(huì)有大量白色沉淀析出。再將白色沉淀以蒸餾水為溶劑75°C下重結(jié)晶兩次，再冷凍干燥。得到干燥高純度的磺化產(chǎn)物(β -⑶-0TS)。
[0015]本發(fā)明提供上述的合成方法制備得到的殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾衍生物。
[0016]本發(fā)明提供上述的殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾衍生物富集微囊藻毒素的方法，包括如下步驟:
1)將殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾衍生物溶解于pH10~11的NaHCO3/ Na2CO3緩沖溶液中；
2)在步驟I)得到的緩沖體系中加入含有微藻囊毒素的樣品，混勻放置進(jìn)行吸附；
3)向步驟2)的體系中加入濃度為0.1-0.5mol/L冰醋酸以沉淀殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾衍生物，離心沉淀得到吸附了微藻囊毒素的衍生物。
[0017]4)三氯乙酸加入濃度50%_70%甲醇水溶液中，構(gòu)成洗脫液，洗脫液中三氯乙酸的體積濃度為0.03-0.07%，以洗脫液洗脫步驟3)得到的吸附了微藻囊毒素的衍生物上的微藻囊毒素。
[0018]本發(fā)明另提供一種上述的殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾衍生物富集微囊藻毒素的方法，包括如下步驟:
I)所述殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾衍生物加入含微囊藻毒素的水樣或含微囊藻毒素的樣品懸濁液放置吸附，離心沉淀得到衍生物； 2)三氯乙酸加入濃度50%-70%甲醇水溶液中，構(gòu)成洗脫液，洗脫液中三氯乙酸的體積濃度為0.03-0.07%，以洗脫液洗脫步驟I)得到的吸附了微藻囊毒素的衍生物上的微藻囊毒素。
[0019]本發(fā)明旨在克服用于微囊藻毒素富集的高分子材料的C18固定相、分子印跡聚合物、活性炭纖維和大孔樹脂等方法對微囊藻毒素的選擇性不高，吸附量較低的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾的衍生物材料制備方法及其微囊藻毒素富集的方法。
[0020]本發(fā)明提供了一種殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾的衍生物材料，殼聚糖具有生物可降解性，無毒性，生物相容性好和低成本的優(yōu)點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)上有許多羥基和氨基基團(tuán)，因此能夠參與許多殼聚糖的修飾反應(yīng)，應(yīng)用化學(xué)修飾的方法來合成具有新的生物功能的殼聚糖衍生物，由于新基團(tuán)的引入而使其具有新的功能。
[0021]本發(fā)明中選用了殼聚糖作為載體，進(jìn)行β -環(huán)糊精(β -CD)的固載，并進(jìn)行磷酸化修飾，合成殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化修飾的衍生物(CTS-⑶-P)，該衍生物通過殼聚糖上的環(huán)糊精和巰基磷酸特異性結(jié)合微囊藻毒素結(jié)構(gòu)中的含有疏水的苯環(huán)結(jié)構(gòu)和帶正電荷精氨酸的胍基，進(jìn)行特異性的結(jié)合。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0023]實(shí)施例1
一、殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾衍生物的合成第一步單-(6-對甲苯基磺?；?β -環(huán)糊精的制備
將55g β -⑶加入435mL的蒸餾水中，將溶有5.2g NaOH的蒸餾水緩慢加入到β -⑶的懸浮液中，一邊滴加一邊攪拌，滴加時(shí)間為8~10min，最后β -⑶完全溶于NaOH中，懸浮液變成透明的β -⑶溶液。再將溶有7.96g對甲基苯磺酰氯的24mL乙腈逐滴到透明的β -⑶溶液中，一邊滴加一邊用玻璃棒攪拌，滴加時(shí)間為10~12min。滴加結(jié)束后，透明的β-CD溶液變成渾濁液。然后于恒溫磁力攪拌器22°C下lOOOr/min攪拌2.5h。反應(yīng)結(jié)束后離心分離得到上清液，將上清液于4°C里放置半天，會(huì)有大量白色沉淀析出。再將白色沉淀以蒸餾水為溶劑75°C下重結(jié)晶兩次，再冷凍干燥。得到干燥高純度的環(huán)糊精磺化物(單-(6-對甲苯基磺酰基)β-環(huán)糊精)。
[0024]第二步殼聚糖固載環(huán)糊精(⑶-CS)的合成
將Ig殼聚糖溶解于40mL 1%的冰醋酸，并將溶解有5g β -環(huán)糊精磺化物的DMF溶液加入其中，攪拌混合均勻，該體系在100°C下冷凝回流48h，于透析袋中純化3天，然后冷凍干燥，得到棉花狀的殼聚糖固載環(huán)糊精(CD-CS)固體。
[0025]第三步殼聚糖固載環(huán)糊精磷酸化雙修飾衍生物(CTS-⑶-P殼聚糖衍生物)的合成將合成得到的0.5g殼聚糖固載環(huán)糊精溶于5mL的甲烷磺酸，然后加入2.5g的P2O5，整個(gè)反應(yīng)在N2的保護(hù)下用玻璃棒不斷的攪拌，在冰浴中進(jìn)行(0-5°C)，通過改變反應(yīng)時(shí)間或P2O5的用量獲得不同取代程度的磷酸化殼聚糖。反應(yīng)完成后，加入乙醚使產(chǎn)物沉淀，離心分離，