核殼型磁性金屬有機骨架納米顆粒的制備及其應用
【專利說明】
【技術領域】
[0001]本發明涉及化工技術領域，具體地說，是一種核殼型磁性金屬有機骨架納米顆粒的制備及其應用。
【【背景技術】】
[0002]蛋白質的可逆磷酸化修飾是最重要的一種蛋白質翻譯后修飾方式之一，調控著眾多生理過程，如細胞分裂、細胞增殖、信號傳導和新陳代謝等。據估計，在同一時刻有30%的蛋白質處于磷酸化修飾狀態，所以對蛋白質的磷酸化機理的研宄對于蛋白組學十分重要。磷酸化蛋白的定量以及定性檢測是了解這些過程的前提。如今，質譜已被證明是分析和鑒定蛋白質磷酸化位點的有效工具。然而，直接用質譜分析樣品仍存在著許多問題。比如，磷酸肽在生物樣品中含量低，質譜分析時離子化效率較低，同時存在大量非磷酸肽干擾信號。因此，在質譜分析復雜樣品前，采用預富集方法進行樣品前處理是十分重要的。
[0003]為了提高樣品中磷酸肽的質譜信號，當前已發展了多種分離技術和富集材料用于富集磷酸肽和磷酸化蛋白，如金屬氧化物親和色譜法(MOAC)，固定金屬離子親和色譜法(IMAC)，強陽離子交換色譜法(SCX)和強陰離子交換色譜法(SAX)等。其中，固定金屬離子親和色譜法已成為一種最重要的技術，其基本原理是基于聚合物基質、多孔基質和納米顆粒表面的金屬離子與磷酸肽基團之間強烈的螯合作用。一系列的不同基質(如硅膠、聚合物、磁球、介孔微粒)的IMAC材料已被廣泛應用于磷酸肽富集中。近年來，微孔IMAC材料由于其較大的比表面積，較大的孔體積，規整的孔結構而被廣泛應用于磷酸肽研宄。鄧等合成了一種多巴胺包裹的介孔硅材料，并在表面修飾有大量的Ti4+，對磷酸化蛋白的富集顯示出較高的選擇性，較低的檢測限，較大的富集容量。盡管已有前人的研宄成果，設計合成出新型的帶有大量作用位點以及易于分離的微孔IMAC材料仍然是磷酸化蛋白富集的一個研宄熱點。
[0004]對于傳統的IMAC技術，樣品的分離需要高速離心，過程繁瑣且目標磷酸肽丟失不可避免。作為一種替代技術，磁性基質因易于制備，便于分離得到了廣泛的關注。近年來功能化的磁性納米材料已被廣泛應用于蛋白組學。對于磷酸肽的富集，研宄者設計出一系列的磁性納米材料，大都顯示出好的選擇以及富集效率。微孔磁性IMAC材料具有大的比表面積，能提供更多的作用位點從而進一步提高富集效率。陸等制備了一種磁性介孔鈦微球，具有大的比表面積，符合窄分布的孔徑，較好的磁響應且對磷酸肽具有較好的特異性以及較大的富集容量。因此，迄今為止，設計新型的介孔磁性IMAC材料仍然是蛋白組學的研宄熱點。
[0005]金屬有機骨架材料是一類以金屬離子為配位中心，與有機配體通過配位作用形成的多孔配位聚合物。金屬有機骨架材料具有超高比表面積、超大孔體積、良好的熱穩定性、介孔孔徑、孔內和孔外易于修飾等優點，被廣泛用于氣體存儲、催化、藥物載體、吸附和分離等領域。因為MOF材料表面易于修飾，且具有孔特征，因此在蛋白組中的應用日漸廣泛。此夕卜，由于nm級的孔徑使得MOF材料對一些較大的蛋白具有體積排阻效應，并捕捉分子量較小的蛋白以及肽段。然而迄今為止很少有具有IMAC特性的MOF材料被用于磷酸肽的富集。鄧等制備了一種基于鋯離子的親水MOF材料，此材料將磁球的易于分離，多巴胺的親水性以及MOF材料的大的比表面積等優點結合，在磷酸化蛋白的富集中顯示出較高的選擇性以及富集效率，但是合成方法較為復雜。因此，用一種簡單，有效的方法制備一種磁性的MOF材料對于磷酸肽的富集仍然是技術熱點。
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【發明內容】
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[0006]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種核殼型磁性金屬有機骨架納米顆粒的制備及其應用。
[0007]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
[0008]一種核殼型磁性金屬有機骨架納米顆粒的制備方法，其具體步驟為:
[0009](I) I?2g的三氯化鐵和70?80mL的乙二醇和3?4g的檸檬酸鈉進行均勻混合，在150?250°C進行高溫水解反應，得到順磁性的磁性納米基質；
[0010](2)將300?400mg步驟⑴制備的順磁性的磁性納米基質分散在80?10mL乙醇溶液中，逐滴加入5?10 μ L的0.3?0.6mmol L—1巰基乙酸機械攪拌20?26小時，得到羧基修飾的磁性納米顆粒，乙醇清洗2?3次；
[0011](3)將100?200mg步驟⑵中制備的羧基修飾的磁性納米顆粒分散在5?1mL的1mmol T1FeCl3.6H20的乙醇溶液，室溫下靜置15?20min，所得納米顆粒用乙醇清洗2?3次除去未被吸附的FeCl3.6H20 ;隨后，把磁性納米顆粒分散于5?1mL含1mmol1711，3，5-均苯三甲酸的乙醇溶液，在70°0下靜置30?60min ;如此循環操作10?40次，得到磁性納米顆粒在150°C下真空干燥12?24小時，得到核殼型磁性金屬有機骨架納米顆粒。
[0012]一種核殼型磁性金屬有機骨架納米顆粒在選擇性富集內源性磷酸肽中的應用，其具體方法為:
[0013](I)將制得的核殼型磁性金屬有機骨架納米顆粒用水和乙腈分別清洗I?3次，去除殘留的反應試劑；
[0014](2)將步驟⑴清洗后的核殼型磁性金屬有機骨架納米顆粒與0.8?1.2mg/L磷酸肽溶液例如α-酪蛋白(a-Casin)酶解液和酪蛋白(β-Casin)酶解液混合溶于體積比為1:1?3: 7的水和乙腈的混合溶液中，20?30°C條件下震蕩孵育30?50min;利用磁分離對含有磷酸化蛋白或者多肽進行選擇性富集和快速分離，實現對高豐度的多肽或蛋白進行的去除和低豐度的磷酸肽或蛋白的富集；
[0015](3)將步驟⑵中吸附多肽或蛋白的磁性金屬有機骨架納米顆粒用5%?10%氨水溶液進行洗脫，利用基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜儀對所富集的肽段進行定性定量分析。
[0016]與現有技術相比，本發明的積極效果是:
[0017]采用多層自主裝法制備了核殼結構磁性金屬有機骨架納米顆粒，Fe3O4OMIL-1OO(Fe)，并將其應用于選擇性富集樣品中的磷酸化肽。完美的孔結構以及大量的Fe3+離子大大增加的材料與磷酸肽的作用位點，提高了材料的選擇性，檢測限，以及富集容量。選用牛血清白蛋白和酪蛋白酶解液考察了 Fe3O4麵IL-100 (Fe)納米顆粒對肽段的吸附性能及對蛋白的排阻