一種喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-親和基質的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物化學及層析領域，更具體涉及一種喹噁啉-2-甲醛-1,4-二 氧-親和基質的制備方法，同時還涉及一種喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧-親和基質的用途。
【背景技術】
[0002] 親和層析技術（Affinity Chromatography, AC)是一種液相色譜方法，是利用生 物大分子與親和色譜固定化配體之間存在的特異性吸附作用力，來進行選擇性分離生物 大分子的方法（于世林，2008;Leslie et al.，2008)，是篩選配體結合蛋白的經典技術 (Hage, 1999)。親和層析技術的最大優點在于它能夠從粗提液中經過一次簡單的處理便可 得到所需高純度的活性物質（陳勇等，2001)。將藥物分子固定到固相載體（如微珠）上， 與細胞蛋白質裂解液充分混合孵育，然后洗脫去除沒有結合的蛋白質，再通過高離子強度 洗脫或是煮沸處理等方法將靶標蛋白與固相載體上的藥物配體分離，這樣上清液中的蛋 白質即為藥物結合蛋白（周婦婦等，2011;〇3111：代03838 6七31.，1971)。因此，藥物小分 子能否偶聯到固相載體（即親和基質）上形成固定化的配體是決定親和色譜成功與否的 關鍵（Cautrecasas，1999)。運用親和層析技術已成功鑒定出多種內源及外源性物質的結 合蛋白，如對植物生長與發育至關重要的脫落酸（Abscisic acid，ABA)的結合蛋白（Shen et al.，2006 ;Zhang et al.，2002)。高效的親和層析方法不僅在藥物與蛋白質的結合 (Joseph et al. ,2010)、藥物革巴標的高通量篩選（Vuignier et al. ,2013)中具有廣泛應 用，在蛋白復合物的分離及蛋白與蛋白相互作用網絡方面同樣扮演著重要角色（Azarkan et al. , 2007 ；Fukao, 2012)〇
[0003] 配體的固定化過程是運用親和層析方法篩選藥物結合蛋白的關鍵步驟 (Cautrecasas et al.,1971)，選擇合適的親和基質對于我們分離與鑒定生物活性化合物 的靶蛋白至關重要。常用的親和基質主要有瓊脂糖凝膠，但是瓊脂糖等固相載體容易親和 非特異性結合蛋白，不能有效分離與生物活性化合物特異性結合的蛋白質，使得靶蛋白鑒 定更加復雜（Kuramochi et al.，2008 ;Shimizu et al.，2000 ;Yamamoto et al.，2006)。 因此在將瓊脂糖親和珠與目標化合物進行偶聯形成固定化配體（immobilized-ligand)的 過程中，連接臂的使用不僅能使藥物與基質順利偶聯，提高配基的空間利用度，還可以避免 基質對革巴蛋白的空間干擾效應（Ziegler et al. ,2013)。脫落酸（Abscisic acid, ABA) 是一種對植物生長與發育至關重要的激素，Zhang等利用EAH-Sepharose 4B基質與ABA 進行偶聯，通過親和層析方法成功篩選到ABA的結合蛋白（Shen et al.，2006;Zhang et al.，2002)。AffiGel是一種瓊脂糖衍生物，因其良好的親水性質而減少非特異性結合蛋 白，使其成為應用最廣泛的偶聯基質（Takahashi et al.，2006)。但是因為大多數藥物的 疏水性質，使得高親水性和化學易碎性的AffiGel與藥物在有機試劑的條件下偶聯困難， 因此能穩定存在于有機試劑中的聚甲基丙烯酸酯衍生物親和基質Toyopearl成為了很好 的替代產品。Takahashi等改進了 Toyopearl親和基質使其具有如同AffiGel -樣親水 性的優點，同時能夠穩定存在于有機試劑中，因而降低了非特異性結合蛋白的結合幾率，同 時提高了偶聯效率（Takahashi et al.，2006)。同時，一些高效能的親和珠，如FG-beads， SG-beads，也用來改變配體偶聯的條件，提高配體的偶聯效率（Shimizu et al.，2000; Sakamoto et al.，2009; Ito et al.，2010)，從而篩選出目標化合物的結合蛋白。
[0004] 喹賽多（Cyadox，CYA)作為一類新型喹噁啉-1，4-二氧化合物，在國內由華中農 業大學獸藥研宄所首次合成，本實驗室對其進行了廣泛而且深入細致的研宄。喹賽多作為 喹噁啉類飼料添加劑，對豬、雞、魚等食品動物具有明顯的抗菌促生長作用。與同類藥物相 比，喹賽多毒副作用小，安全性高，屬于實際無毒物質，且用藥后吸收迅速，殘留期短，具有 良好的應用前景。將喹賽多以飼料添加劑的形式添加于仔豬日糧當中，能夠顯著提高仔 豬體增重，并且其肝臟組織中表皮生長因子（EGF)和胰島素樣生長因子-l(IGF-l)信使 RNA(mRNA)的表達也得到顯著性提高（p < 0. 05)，因此推測喹賽多可能是通過對動物體內 EGF和IGF-1等生長因子的轉錄調控而發揮作用（王國永，2004)。朱惠玲則從內分泌角度， 全面系統的研宄了喹賽多促進仔豬生長的作用機制。研宄推測喹賽多主要通過兩種機制發 揮其促生長效應：一是通過提高血液中生長激素（GH)、胰島素、性激素、IGF等激素水平，同 時降低皮質醇（C0R)與生長抑素（SS)濃度，從而加速體內同化作用，刺激骨骼肌蛋白的合 成，并抑制蛋白質的分解；二是通過提高EGF、IGF-1、胰島素及胃泌素（Gas)水平，改善胃腸 道黏膜的結構與功能，從而促進營養物質的吸收與利用（朱惠玲，2007)。丁明星研宄也發 現喹賽多可以增加小腸絨毛膜表面積，促進營養物質的吸收（丁明星，2005)。戴夢紅等應 用mRNA差異顯示技術篩選出在喹賽多作用下，豬肝臟組織中差異表達的8條基因，包括鋅 指蛋白（Zinc Finger CCHC3)、抗細胞衰亡因子1(DAD1)、補體C3(C3)、EGF和IGF-1等5條 與喹賽多作用正相關的基因，兩條表達量上調但隨著喹賽多劑量增加表達量不變的差異基 因，分別是轉酮醇酶（TK)、ADP核糖聚合酶（PARP-1)，還有一條表達量與喹賽多劑量呈負相 關的新基因（戴夢紅等，2009)。在此基礎上，邢丹與郭菊就喹賽多作用下差異表達的8條 基因信號通路與表達調控進行了研宄，發現多條信號通路參與喹賽多對差異基因的表達調 控，其中磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K)與核轉錄因子-kB(NF-kB)信號通路是主要的調控 通路，發揮喹賽多的藥理作用（郭菊，2012;邢丹，2012)。與此同時，利用雙向電泳與生物 質譜技術篩選并鑒定了喹賽多在L-02細胞與豬原代肝細胞中相關蛋白質的表達，結果顯 示這些差異蛋白主要參與三羧酸循環等與能量代謝相關的過程，從而發揮喹賽多藥理作用 (劉亞輝，2012)。雖然喹賽多促生長作用機理得到了較為細致的詮釋，但是其在細胞內作用 靶標一直未能確定。有文獻報道，藥物的作用靶標主要為蛋白質（邱宗蔭等，2008)。黨永 輝利用放射性同位素氚標記喹賽多，通過在體與離體實驗篩選其在豬肝臟組織中的結合蛋 白，結果發現，氚標喹賽多在細胞核蛋白裂解液中隨著孵育濃度的升高而趨于飽和，但是并 沒有成功篩選到能與喹賽多特異性結合的蛋白質（黨永輝，2012)。喹賽多作用細胞之后， 是否有特異性結合蛋白與之相互作用，打通下游信號通路，從而發揮其促生長的藥理作用， 對我們研宄喹賽多的促生長機理具有重要意義。雖然喹賽多的促生長作用已在基因水平、 蛋白水平以及整體動物的水平得以闡釋，但是喹賽多激發這些效應的基礎是什么還不甚明 了。而藥物與細胞內或細胞膜靶標之間的相互作用，是藥物發揮作用的基礎（周婷婷等， 2011)〇
[0005] 肝臟是藥物代謝的主要器官，胥寧研宄喹賽多在動物體內的分布與消除規律發 現，在豬肝臟與腎臟中藥物消除最慢（胥寧，2012)。通過前期在體與離體試驗研宄發現，喹 賽多能夠上調EGF、IGF-lmRNA的表達（黨永輝，2012 ;王國永，2004)。L-02細胞系是從成 人正常肝臟分