凈化β-玉米赤霉醇和氯霉素復合免疫親和柱及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種凈化β-玉米赤霉醇和氯霉素復合免疫親和柱的制備與應用，更 確切的說是β -玉米赤霉醇和氯霉素免疫親和柱的制備方法，免疫親和柱凈化-液相色譜 法檢測β-玉米赤霉醇和氯霉素檢測方法的建立。
【背景技術】
[0002] 玉米赤霉醇，又名"右環十四酮酚"，是玉米赤霉菌在生長過程中產生的次生代謝 產物玉米赤霉烯酮的還原產物，屬于雷索酸內酯類非留體類同化激素。玉米赤霉烯酮及其 代謝產物一 α -玉米赤霉稀醇、β -玉米赤霉稀醇、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和β -玉米赤 霉醇均可能污染飼料，造成動物產品中檢出玉米赤霉醇殘留。玉米赤霉醇是一種效果理想 的皮埋增重劑，系非固醇、非激素類化合物。但實驗證明其對哺乳動物具有一定的危害性， 1998年歐盟禁止將玉米赤霉醇等激素類藥物應用于畜禽養殖，2002年，中國農業部第193 號公告明確規定玉米赤霉醇禁用于所有食品動物，所有可食動物不得檢出。2010年衛生部 發布的《食品中可能違法添加的非食用物質名單（第四批）》中明確將玉米赤霉醇列入非食 用物質。
[0003] 氯霉素是由委內瑞拉鏈絲菌產生的抗生素。屬抑菌性廣譜抗生素。敏感菌有腸桿 菌科細菌及炭疽桿菌、肺炎球菌、鏈球菌、李斯特氏菌等。衣原體、鉤端螺旋體、立克次體也 對本品敏感。因對造血系統有嚴重不良反應，需慎重使用。氯霉素曾廣泛用于治療各種敏 感菌感染，后因對造血系統有嚴重不良反應，故對其臨床應用現已做出嚴格控制。可氯霉素 為廣譜抗生素，由于其對血液系統的毒性較大，故已較少用。外用其滴眼劑防治眼部感染。 注意：①主要不良反應有粒細胞及血小板減少、再生障礙性貧血等。②久用可致視神經炎、 共濟失調及二重感染等。③有時有消化道反應。④新生兒可致灰嬰綜合癥，故禁用。⑤精 神病人可致嚴重反應，故禁用。⑥肌注易致嚴重反應。甲砜霉素抗菌譜與氯霉素相似，且不 會出現再生障礙性貧血。但是腎功能不良時需減小劑量。兒童可服用無味氯霉素。嬰幼兒 應用氯霉素應十分謹慎，除非無其他藥物替代而必須使用時方考慮，有條件時可進行血藥 濃度監測。
[0004]目前，玉米赤霉醇和氯霉素的檢測方法主要有薄層層析法，酶聯免疫法 (ELISA)，免疫親和層析-液相色譜法，免疫親和層析-熒光光度法等。薄層層析法，要接觸 大量的標準品，不利于實驗者的健康，而且靈敏度很低。酶聯免疫法，只適用于定性檢測， 很容易出現假陽性和假陰性的現象。免疫親和層析-液相色譜法可以定量地檢測許多商 品中的β-玉米赤霉醇和氯霉素的含量。由于采用了先進的生物技術，該方法可以檢測出 β -玉米赤霉醇和氯霉素，而不使用有毒的溶劑如氯仿和二氯甲烷。因此，當務之急，要制備 出性能穩定的免疫親和柱，并建立一種經濟，快捷，精確，安全的試驗方法。
【發明內容】
[0005] 為了解決現有技術中檢測β -玉米赤霉醇和氯霉素亟需性能穩定的免疫親和柱 的問題，本發明提供了一種玉米赤霉醇和氯霉素復合免疫親和柱及其制備方法與在 HPLC檢測中的應用。
[0006] 為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：一種凈化β-玉米赤霉醇和氯 霉素復合免疫親和柱的制備方法如下：
[0007] a)基質制備
[0008] 稱取Ig瓊脂糖凝膠基質粉末，溶于lmmol/L HCl中，然后置于燒結玻璃過濾器中 使用 lmm〇l/L HCl 洗絳 15min ;
[0009] b)配體偶聯
[0010] 使用偶聯緩沖液〇. 2mol/L NaHC03pH8. 3溶解待偶聯的β-玉米赤霉醇抗體和氯 霉素抗體，獲得抗體溶液，迅速將步驟a)活化的瓊脂糖凝膠基質轉移到所述抗體溶液中， 充分混勻上述的混和物2-4h ;
[0011] c)配體封閉
[0012] 封閉所有殘留的活性基團，轉移經步驟b)處理的瓊脂糖凝膠基質至0. lmol/L Tris-HCl緩沖液中，室溫條件下靜置2-4h ;
[0013] d)除去偶聯后未偶聯上的多余的配體
[0014] 依次用0· lmol/L醋酸/醋酸鈉緩沖液和0· lmol/L Tris-HCl緩沖液對經步驟c) 處理后的瓊脂糖凝膠基質進行洗滌，至少洗滌3個循環；
[0015] e)裝柱
[0016] 用5倍所述瓊脂糖凝膠體積的0. 01 % NaN3-PBS洗滌，并使用0. 01 % NaN3-PBS保 存，然后裝柱。
[0017] 在以上獲得復合免疫親和柱（IAC)的基礎上，本發明建立了利用液相色譜法檢測 β -玉米赤霉醇和氯霉素檢測的方法：當含有β -玉米赤霉醇和氯霉素的樣品通過IAC時， 免疫吸附劑就會特異性的吸附β -玉米赤霉醇和氯霉素，其他的雜質則流出IAC柱，然后用 甲醇將β -玉米赤霉醇和氯霉素從柱子中洗脫下來，樣品得到了很好的凈化。
[0018] 用所述復合免疫親和柱凈化待測樣液，然后用色譜級甲醇洗脫親和柱，流速為 lmL/min~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供HPLC分析；
[0019] 高效液相色譜條件
[0020] β -玉米赤霉醇
[0021] 色譜柱：Cloversil-C18, 4. 6X250mm
[0022] 流動相：乙腈：甲醇：水=43:7:50 (v/v)
[0023] 流速：0. 8mL/min
[0024] 檢測器：紫外檢測器，波長265nm
[0025] 進樣體積：50~IOOuL ;
[0026] 氯霉素：
[0027] 色譜柱：Cloversil-C18, 4· 6X 150mm
[0028] 流動相：甲醇：水=50:50 (v/v)
[0029] 流速：0· 8mL/min
[0030] 檢測器：紫外檢測器，波長278nm
[0031] 進樣體積：50~IOOuL ;
[0032] 定量
[0033] 用進樣器吸取50 μ L標準工作液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定標 準溶液的響應值，分別得到標準溶液高效液相色譜圖。
[0034] 本發明制備的復合免疫親和柱可以有效地利用到β -玉米赤霉醇和氯霉素的液 相色譜檢測中，使檢測快捷，精確，安全。
【附圖說明】
[0035] 圖1為樣品中玉米赤霉醇類的色譜圖；
[0036] 圖2為樣品中氯霉素的色譜圖。
【具體實施方式】
[0037] 實例一：
[0038] 制備抗β -玉米赤霉醇（ZER)單克隆抗體；氯霉素抗體為市售產品。
[0039] 動物免疫：免疫動物為6-8周齡左右，雌性BALB/c小鼠。免疫原：ZER-BSA免疫5 只小鼠。取適量免疫原（IOOyg/只）加等量弗氏完全佐劑，制成乳化劑進行免疫，之后佐 劑改為不完全佐劑，共免疫6次，每次間隔2周。除第一次為頸背部皮下多點注射外，其余 均為腹腔注射。
[0040] 細胞融合：脾細胞和雜交瘤細胞按照10:1的比例進行細胞融合試驗。
[0041] 雜交瘤細胞克隆化：采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，直到得到對β -玉米赤霉 醇有很好的特異性反應的細胞。最后篩選出分泌β-玉米赤霉醇抗體的雜交瘤細胞9208， 制備出單克隆抗體。抗β-玉米赤霉稀醇單克隆抗體細胞已于2014年5月5日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，CGMCC的地址為北京市朝陽區北 辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC No. 9208。 實例二：
[0042] 本實例為玉米赤霉醇和氯霉素復合免疫親和柱的制備
[0043] 1.基質制備
[0044] 稱取所需Ig的瓊脂糖凝膠（Sepharose)基質粉末（每克凍干基質粉末可形成 3.5ml終體積的溶脹基質），溶于lmmol/L HCl中。基質將會立即溶脹，然后置于燒結玻璃 過濾器中使用lmm〇l/L HCl洗絳15min。
[0045] 2.配體（抗體）偶聯
[0046] a使用偶聯緩沖液0. 2mol/L NaHC03pH8. 3溶解待偶聯的雜交瘤細胞9208分泌的 β -玉米赤霉醇抗體和市購的氯霉素抗體，抗體濃度為8. 5mg/ml，溶解的抗體置于冰浴中 暫存。在一個帶蓋的可完全密封的容器中加入上述含有抗體的偶聯緩沖液。迅速將CNBr 活化的Sepharose轉移到抗體溶液中。室溫條件（20_25°C )下采用end-over-end的方式 充分混勻上述的混和物2-4h，
[0047] b偶聯率的計算：離心，2, 000RMPX lmin，將s印harose離心至管底，將上清液轉移 至新的離心管中，測定上清液的蛋白質含量值。計算偶聯率為99.3% (說明偶聯很成功）。 取離心至管底的sepharose，使用偶聯緩沖液進行洗滌，除去多余的配體。
[0048] c封閉：封閉所有殘留的活性基團。轉移基質至0. lmol/L Tris-HCl緩沖液中。室 溫條件下靜置2-4h。
[0049] d為除去偶聯后未偶聯上的多余的配體，依次用低、高兩種pH的緩沖液對基質進 行洗滌，至少洗滌3個循環，每種緩沖液的使