擴張床色譜與逆流色譜在線聯用方法、應用及裝置的制造方法
【專利說明】擴張床色譜與逆流色譜在線聯用方法、應用及裝置 【技術領域】
[0001] 本發明涉及色譜裝置技術領域，具體地說，是一種擴張床色譜與逆流色譜在線聯 用方法、應用及裝置。 【【背景技術】】
[0002] 天然產物包含的化學成分非常復雜，其中起療效作用的有效成分種類繁多，包括 蛋白、多糖、氨基酸、生物堿、揮發油、黃酮類、鞣質、萜類、留體化合物等天然成分。提取分離 有效成分及有效部位可以降低原藥材的毒性，提高其療效，對于促進天然產物發展有著重 要的意義。制約天然產物制藥業的關鍵因素之一是對有效成分的提取和分離，傳統的提取 分離方法，普遍存在著有效成分提取率低、能耗高、工序多和生產周期長等缺點。隨著我國 中藥現代化進程的加速，中藥相關產品的質量標準不斷提高，特別是指紋圖譜及多指標成 分定量研究工作的開展，對中藥對照品的數量及品種的需求也越來越大。另一方面，中藥中 的單體化合物也是西藥及先導化合物的重要來源。在這些藥物的研制過程中，藥效篩選需 要一定量的單體化合物，先導化合物的修飾更需要一定量的單體化合物。從天然產物中直 接提取單體成分可以大大降低成本。隨著現代科技的不斷發展，在藥物研發中，為了達到減 少雜質、提高藥效，降低成本這些目標，一些現代的高新工程技術正在不斷地被借鑒到藥物 生產中來。
[0003] 擴張床吸附（Expanded Bed Adsorption,EBA)是上世紀九十年代發展起來的新型 分離純化技術，集澄清、濃縮和初步純化于一體的新型集成操作過程，可以減小離心或過濾 等單元操作步驟，降低分離純化的成本，簡化了純化工藝，是一項應用廣闊的分離技術。目 前擴張床主要用于生物樣品的分離純化，較少應用于中藥分離。集成化分離是將固液分離 和液液分離集中到擴張床分離過程中，實現操作的簡便化和過程的高效化。
[0004] 擴張床作為一種特殊化的流化床技術，在低流速條件下操作，能使床層達到穩定 的分級，故返混較小，接近于固定床。擴張床吸附劑有一定的粒徑和密度分布，在操作過程 中粒徑大的或密度大的吸附劑顆粒分布在床層底部，粒徑小的或密度小的顆粒分布在床層 上部。控制適當的操作條件，就可以使顆粒在床體中的返混運動受到限制，從而使吸附劑達 到分層的要求。單個顆粒僅在小范圍內做圓周運動，液相流動為活塞流。分層后的擴張床 床體具有高于固定床的空隙率，這可以使固體顆粒穿過床體，這也是擴張床能夠處理含有 固體顆粒提取液的原因。
[0005] 高速逆流色譜技術（High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)是當 前國際上較新型無固體載體的液-液分配技術，最初由美國國立健康研究院Ito教授研制 開發，經過十余年的研發，CCC進一步發展成高速逆流色譜。由于其克服了傳統固相載體對 樣品的死吸附作用，以及與相關的分析、分離技術聯用非常適合天然產物研究工作。
[0006] 高速逆流色譜與傳統的色譜法相比較具有明顯的不同，主要在以下幾個方面：（1) 由于高速逆流色譜為連續的液液分配色譜，無需固體支持，避免了樣品在分離過程中的不 可逆性吸附、分解等問題，適合天然活性成分的分離。（2)由于液體作為流動相和固定相，滯 留在柱中的樣品可以通過多種洗脫方式予以完全回收，能夠同時完成分離純化與制備，適 于制備性分離。（3)高速逆流色譜可以通過對溶劑系統的改變，對不同極性范圍的化合物進 行分離，特別符合天然產物的復雜、多樣性的特點。（4)與HPLC相比，HSCCC進樣量較大，最 多可達數克，是HPLC的數百倍。與常壓、低壓色譜相比。HSCCC的分離能力強，有些樣品經 一次分離即得到1個甚至多個化合物，并且分離時間短，數小時即可完成，純度多在98%以 上。（5)可以采用多種洗脫方式，如等比例洗脫、梯度洗脫，或者雙向洗脫方式對樣品進行有 效的分離。基于以上特點高速逆流色譜被廣泛的應用于生物醫藥、農業食品，特別是天然藥 物化學等領域。
[0007] 在線聯用技術是將兩種或兩種以上的方法通過接口結合起來使用的技術，它們相 互取長補短、協同作用，不僅可以提高方法的靈敏度、準確度，還可能獲得兩種方法單獨使 用時所不具備的功能。因此，在線聯用技術一直是分析化學研究的前沿領域之一。其中，色 譜聯用技術發展最為迅速。色譜作為一種非常有效的分離方法，常常與其他定性方法聯用， 實現對復雜混合物的分析。另一方面，一種色譜也可以與另外一種色譜方法聯用（二維色 譜），以發揮不同分離模式色譜各自特有的分離能力。
[0008] 雖然色譜聯用技術已發展多年，但其依然是分析化學領域的研究熱點之一。色譜 聯用技術正朝著多維、小尺度等方向發展，且涉及到的方法和技術也日益增多，如氣相色 譜、高效液相色譜、超臨界流體色譜等分離方法與紫外、質譜、紅外、核磁共振、近紅外等分 析方法聯用。多維色譜分離技術是將樣品注入呈正交分布的多個分離體系中，樣品中各組 分以進樣點為原點在多維的分離方向上展開。其優點在于分離能力強，峰容量高，省去了復 雜的前處理步驟，可用于極其復雜體系的分離與分析。未來聯用技術會成為解決常規分析 問題的有力手段。
[0009] 將擴張床和逆流色譜聯用，可充分發揮二者的優勢。擴張床色譜用于天然產物的 提取和第一維初步分離，所得組分通過接口轉移至第二維高速逆流色譜進一步純化，得到 目標化合物。由此可見，擴張床與高速逆流色譜聯用系統可以實現從天然產物中一步獲得 單體化合物，是一種快速、高效、損耗小的色譜在線聯用模式。 【
【發明內容】
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[0010] 本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種擴張床色譜與逆流色譜在線聯 用方法、應用及裝置；本發明可以將天然產物材成分提取、濃縮、純化等多個操作步驟集成 于一步完成，能大大縮短操作時間、減少樣品損失、提高收率、降低生產成本。通過一個單元 的操作，便直接可以從天然產物材中分離出有效單體成分的提取分離天然產物有效單體成 分的方法和裝置。
[0011] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：
[0012] 一種擴張床色譜與逆流色譜在線聯用的裝置，其包含提取裝置，其特征在于，提取 裝置通過管路連接第一三通閥；第一三通閥通過管路分別連接第一儲液罐和蠕動泵；蠕動 泵通過管路連接第二三通閥；第二三通閥通過管路連接第三三通閥和第四三通閥；其中第 四三通閥通過管路連接擴張床色譜柱上部和提取裝置；第三三通閥通過管路連接擴張床色 譜柱底部和第一檢測器；檢測器通過管路連接六通閥的第一端口 I;六通閥的第二端口 II， 六通閥的第五端口 V通過管路連接聯用接口；六通閥的第三端口 III通過管路連接恒流泵； 恒流泵通過管路連接第二儲液罐；六通閥的第四端口 IV通過管路連接逆流色譜儀；六通閥 的第六端口 VI通過管路連接第三儲液罐；逆流色譜儀通過管路連接第二檢測器；第二檢測 器通過管路連接自動餾分收集器。
[0013] 所述提取裝置為帶加熱套的提取罐，超聲提取裝置，微波提取裝置，滲漉提取裝 置，仿生提取裝置或半仿生提取裝置中的一種。
[0014] 所述聯用接口為定量環接口，捕集柱接口或者真空溶劑蒸發接口中的一種。
[0015] 所述的檢測器為紫外檢測器，蒸發光散射檢測器或者熒光檢測器中的一種。
[0016] 一種擴張床色譜與高速逆流色譜在線聯用裝置在天然產物中一步制備純化合物 中的應用。
[0017] 一種擴張床色譜與高速逆流色譜在線聯用裝置在天然產物中一步制備純化合物 的應用方法，其包括以下步驟：
[0018] (1)將天然產物置于提取裝置中，加入提取試劑，進行提取；
[0019] 所述的天然產物為動物，植物和微生物等多種含有生物活性物質；
[0020] 所述的提取試劑為甲醇溶液，乙醇溶液，無機鹽溶液，稀酸溶液或稀堿溶液；
[0021] (2)提取的同時，用蠕動泵將提取裝置中提取液通過第一三通閥，第二三通閥，第 三三通閥由下而上輸送至擴張床色譜柱中，被擴張床色譜柱中的吸附介質吸附后，吸附余 液通過第四三通閥流回至提取裝置中繼續參與提取，形成對藥材的循環提取；
[0022] 所述的擴張床色譜柱中所用的填料為大孔吸附樹脂，離子交換樹脂，多孔玻璃，葡 聚糖-硅膠等擴張床常用吸附基質；
[0023] (3)提取完畢，關閉提取裝置，通過蠕動泵將第一儲液罐中的洗脫溶劑由第一三通 閥，第二三通閥，第四三通閥從擴張床色譜柱頂部由上而下輸送至擴張床色譜柱中，進行洗 脫；
[0024] (4)通過蠕動泵將洗脫液經由第一儲液罐，第一三通閥，第二三通閥，第三三通閥， 第一檢測器，六通閥的第一端口 I，六通閥的第二端口 II，六通閥的第五端口 V輸送聯用接 口，完成第一部分樣品的處理與收集；
[0025] (5)用恒流泵將第二儲液罐中的固定相泵入逆流色譜儀中，待固定相充滿色譜柱 后，將逆流色譜儀主機轉速調至設定值，以恒定流速泵入第二儲液罐中的流動相；
[0026] (7)待兩相在逆流色譜儀中達到平衡后，切換六通閥，連同六通閥的第一端口 I和 六通閥的第六端口VI，六通閥的第五端口 V和六通閥的第四端口IV，六通閥的第三端口 III 和六通閥的第二端口 II，用恒流泵將聯用接口中的樣品溶液注入逆流色譜儀中進行分離；
[0027] (8)調節第二檢測器，根據檢測器譜圖，使用自動餾分收集器收集目標成分；
[0028] 所述的目標成分指預提取或分離的天然產物的有效成分；
[0029] 與現有技術相比，本發明的積極效果是：
[0030] (1)本發明從天然產物中一步制備純化合物的擴張床色譜與高速逆流色譜在線聯 用方法及裝置，集合了過去天然產物提取和逆流色譜樣品前處理過程中離心、過濾、濃縮、 復溶等多個步驟于一個操作單元，具有時間短、效率高的特點；
[0031] (2)本發明及裝置采用全封閉操作環境，減少了外界環境的接觸，可避免樣品的污 染和損耗；
[0032] (3)由于本發明提取分離耗時短，可減少樣品與熱源的接觸時間，能防止樣品受熱 降解導致的損耗。 【【附圖說明】】
[0033] 圖1本發明的結構示意圖；
[0034] 附圖中的標記為：1提取裝置，2第一三通閥，3第一儲液罐，4蠕動泵，5第二三通 閥，6第三三通閥，7第四三通閥，8擴張床色譜柱，9第一檢測器，10六通閥，11恒流泵，12第 二儲液罐，13第三儲液罐，14聯用接口，15逆流色譜儀，16第二檢測器，17自動餾分收集器； I第一端口，II第二端口，、III第三端口，IV第四端口，V第五端口，VI第六端口。 【【具體實施方式】】
[0035] 以下提供本發明一種