一種山萵苣素苦素分子印跡整體柱的制備方法與流程

本發明提供一種山萵苣素苦素分子印跡整體柱的制備方法，該印跡聚合物對山萵苣素苦素表現出良好的選擇性和特異性，可用于山萵苣素苦素的分離純化。

背景技術：

山萵苣素苦素是一種倍半萜內酯類化合物，具有保肝作用、抗腫瘤、抗拒食、抗菌抗瘧、抗病毒等多種生物學與藥理學活性。因此，山萵苣素苦素在醫療和保健領域具有很好的應用前景。但是，由于山萵苣素苦素在植物中含量較低，若利用傳統方法進行提純分離，費事費力效率低；采用制備液相進行提純分離，效果不佳，回收率極低；采用高速逆流色譜進行提純分離，進樣量小，周期長，儀器價格昂貴，難于普遍應用。因此，一種高效低廉的提純分離方法顯得尤其重要。

分子印跡是一種基于“鎖鑰原理”，通過模仿生物細胞中酶與底物間的相互作用，人工合成的具有特異選擇性的新興技術材料。分子印跡的方法十分簡單，并且易于操作，工作中需要的原料有：功能單體，模板，溶劑以及交聯劑等。分子印跡技術是將目標分子作為模板，與功能單體、交聯劑、引發劑等混合，在一定條件下發生聚合反應，形成聚合物后再將印跡分子從中抽提洗出，制得分子印跡聚合物(mip)。mip對目標分子在三維空間和官能團上具有“記憶”功能。因此，mip可以特異性的識別目標分子。固相萃取(spe)是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離和富集目標化合物的分離純化技術。綜上所述，如果將分子印跡技術和固相萃取技術的優點結合，即以分子印跡技術所制得的具有特異性識別能力的分子印跡聚合物作為固相萃取技術的固體吸附劑，完全有可能實現對粗提物中某一目標分子的分離純化。

技術實現要素：

本發明的目的是，提供一種山萵苣苦素印跡整體柱的制備方法，該方法以少量的山萵苣苦素為模板分子，加入擁擠試劑聚苯乙烯，以四氫呋喃溶液做溶劑，以甲苯做致孔劑，再加入功能單體4-乙烯基吡啶、交聯劑二甲基丙烯酸乙二醇酯和引發劑偶氮二異丁腈，然后超聲溶解除去溶解氧，接著在水浴中進行聚合反應，最后得到具有選擇性的山萵苣苦素分子印跡整體柱。本發明所述方法模板消耗量少，大大地降低了山萵苣苦素的印跡成本。在不銹鋼柱管中成功合成了山萵苣苦素印跡整體柱，以及空白對照柱并進行色譜性能優化。實驗結果表明，印跡因子最高可達2.20。該方法制備簡單，且高分子聚合物耐用性好，為山萵苣苦素的分離純化提供了一條新路徑。

本發明所述的一種山萵苣苦素分子印跡整體柱的制備方法，按下列步驟進行：

a、將山萵苣苦素和4-乙烯基吡啶按摩爾比1:30-120溶于濃度為40mg/ml含聚苯乙烯的四氫呋喃溶液中，加入40mg的自由基引發劑偶氮二異丁腈，然后加入0-40mg聚乙二醇，再加入565μl二甲基丙烯酸乙二醇酯和229μl甲苯，超聲30分鐘，使各組分完全溶解混勻，得到一均相溶液，然后向該溶液中充氮氣，除去溶解在其中的氧氣，待溶液澄清后，將溶液轉移至不銹鋼管中，快速封住不銹鋼管的兩端，在溫度55℃恒溫水浴中反應24小時；

b、將步驟a得到的不銹鋼柱從水浴鍋中取出，裝上柱頭，連接在高壓輸液泵上，分別以200ml四氫呋喃，體積比9:1的甲醇-乙酸200ml的溶液依次沖洗整體柱，流速為1.0ml/min，沖洗完畢后即可得到山萵苣苦素印跡整體柱。

步驟a中聚苯乙烯的平均相對分子質量為350,000。

步驟a中聚乙二醇平均相對分子質量為6,000。

本發明所述的一種山萵苣苦素分子印跡整體柱的制備方法，相比于空白對照柱，該方法制備的整體柱的色譜性能評價結果表明：山萵苣苦素分子印跡整體柱對山萵苣苦素的保留性能較強。因此，本發明可用于山萵苣苦素的分離純化。

附圖說明

圖1為本發明山萵苣苦素在山萵苣苦素分子印跡整體柱及其空白對照柱上的不同色譜行為，其中a為空白對照柱子，b為山萵苣苦素分子印跡整體柱；

圖2為本發明山萵苣苦素印跡整體柱上山萵苣苦素和類似物的色譜保留圖，其中1為山萵苣苦素在印跡整體柱上的保留；

圖3為本發明空白對照柱上山萵苣苦素和類似物的色譜保留圖，其中a為山萵苣苦素在空白柱上的保留。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步詳細闡述本發明。

實施例1

原位聚合法制備山萵苣苦素分子印跡整體柱：

a、將山萵苣苦素和4-乙烯基吡啶按摩爾比1:60溶于2029μl濃度為40mg/ml含聚苯乙烯的四氫呋喃溶液中，其中聚苯乙烯的平均相對分子質量為350,000，加入40mg的自由基引發劑偶氮二異丁腈，再加入565μl二甲基丙烯酸乙二醇酯和229μl甲苯，超聲30分鐘，使各組分完全溶解混勻，得到一均相溶液，然后向該溶液中充氮氣，除去溶解在其中的氧氣，最后將溶液轉移至100mm×4.6mm不銹鋼管中，并封住不銹鋼管的兩端，將不銹鋼柱放入溫度55℃恒溫水浴中反應24小時；

b、將步驟a得到的不銹鋼柱從水浴鍋中取出，裝上柱頭，連接在高壓輸液泵上，分別以200ml四氫呋喃，體積比9:1的甲醇-乙酸200ml的溶液依次沖洗整體柱，流速為1.0ml/min，沖洗完畢后即可得到山萵苣苦素印跡整體柱。

用高效液相色譜法對山萵苣苦素分子印跡整體柱進行色譜性能評價：參數設置：紫外吸收波長256nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃，進樣體積20μl，用乙腈將山萵苣苦素分子印跡整體柱沖洗至基線水平，然后進樣，測定山萵苣苦素在印跡柱的保留時間tr，并用千分之一的丙酮來標定柱子的死時間t0，根據公式k’＝(tr-t0)/t0，計算得山萵苣苦素印跡因子達到2.20，印記效果展示于圖1。

實施例2

原位聚合法制備山萵苣苦素分子印跡整體柱：

a、將山萵苣苦素和4-乙烯基吡啶按摩爾比1:30溶于2029μl濃度為40mg/ml含聚苯乙烯的四氫呋喃溶液，其中聚苯乙烯的平均相對分子質量為350,000，然后加入40mg的自由基引發劑偶氮二異丁腈，再加入565μl二甲基丙烯酸乙二醇酯和229μl甲苯，超聲30分鐘，使各組分完全溶解混勻，得到一均相溶液，然后向該溶液中充氮氣，除去溶解在其中的氧氣，最后將溶液轉移至100mm×4.6mm不銹鋼管中，并封住不銹鋼管的兩端，將不銹鋼柱放入溫度55℃恒溫水浴中反應24小時；

b、將步驟a得到的不銹鋼柱從水浴鍋中取出，裝上柱頭，連接在高壓輸液泵上，分別以200ml四氫呋喃，體積比9:1的甲醇-乙酸200ml的溶液依次沖洗整體柱，流速為1.0ml/min，沖洗完畢后即可得到山萵苣苦素印跡整體柱。

用高效液相色譜法對山萵苣苦素分子印跡整體柱進行色譜性能評價：參數設置：紫外吸收波長256nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃，進樣體積20μl，用乙腈將山萵苣苦素分子印跡整體柱沖洗至基線水平，然后進樣，測定山萵苣苦素在印跡柱的保留時間tr，并用千分之一的丙酮來標定柱子的死時間t0，根據公式k’＝(tr-t0)/t0，計算得山萵苣苦素印跡因子達到1.46。

實施例3

原位聚合法制備山萵苣苦素分子印跡整體柱：

a、將山萵苣苦素和4-乙烯基吡啶按摩爾比1:120溶于2029μl濃度為40mg/ml含聚苯乙烯的四氫呋喃溶液，其中聚苯乙烯的平均相對分子質量為350,000，加入40mg的自由基引發劑偶氮二異丁腈，再加入565μl二甲基丙烯酸乙二醇酯和229μl甲苯，超聲30分鐘，使各組分完全溶解混勻，得到一均相溶液，然后向該溶液中充氮氣，除去溶解在其中的氧氣，最后將溶液轉移至100mm×4.6mm不銹鋼管中，并封住不銹鋼管的兩端，將不銹鋼柱放入溫度55℃恒溫水浴中反應24小時；

b、將合成的不銹鋼柱從水浴鍋中取出，裝上柱頭，連接在高壓輸液泵上，分別以200ml四氫呋喃，體積比9:1的甲醇-乙酸200ml的溶液依次沖洗整體柱，流速為1.0ml/min，沖洗完畢后即可得到山萵苣苦素印跡整體柱。

用高效液相色譜法對山萵苣苦素分子印跡整體柱進行色譜性能評價。參數設置：紫外吸收波長256nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃，進樣體積20μl。用乙腈將山萵苣苦素分子印跡整體柱沖洗至基線水平，然后進樣，測定山萵苣苦素在印跡柱的保留時間tr，并用千分之一的丙酮來標定柱子的死時間t0，根據公式k’＝(tr-t0)/t0，計算得山萵苣苦素印跡因子達到1.61。

實施例4

原位聚合法制備山萵苣苦素分子印跡整體柱：

a、把山萵苣苦素和4-乙烯基吡啶按物質的量比1:60溶于2029μl濃度為40mg/ml含聚苯乙烯的四氫呋喃溶液中，其中聚苯乙烯的平均相對分子質量為350,000，加入40mg的自由基引發劑偶氮二異丁腈，然后加入平均相對分子質量為6,000聚乙二醇10mg，再加入565μl二甲基丙烯酸乙二醇酯和229μl甲苯，超聲30分鐘，使各組分完全溶解混勻，得到一均相溶液，然后向該溶液中充氮氣，除去溶解在其中的氧氣，最后將溶液轉移至100mm×4.6mm不銹鋼管中，并封住不銹鋼管的兩端，將不銹鋼柱放入溫度55℃恒溫水浴中反應24小時；

b、將步驟a得到的不銹鋼柱從水浴鍋中取出，裝上柱頭，連接在高壓輸液泵上，分別以200ml四氫呋喃，體積比9:1的甲醇-乙酸200ml的溶液依次沖洗整體柱，流速為1.0ml/min，沖洗完畢后即可得到山萵苣苦素印跡整體柱。

用高效液相色譜法對山萵苣苦素分子印跡整體柱進行色譜性能評價：參數設置：紫外吸收波長256nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃，進樣體積20μl，用乙腈將山萵苣苦素分子印跡整體柱沖洗至基線水平，然后進樣，測定山萵苣苦素在印跡柱的保留時間tr，并用千分之一的丙酮來標定柱子的死時間t0，根據公式k’＝(tr-t0)/t0，計算得山萵苣苦素印跡因子達到1.33。

實施例5

原位聚合法制備山萵苣苦素分子印跡整體柱：

a、將山萵苣苦素和4-乙烯基吡啶按摩爾比1:60溶于2029μl濃度為40mg/ml含聚苯乙烯的四氫呋喃溶液中，其中聚苯乙烯的平均相對分子質量為350,000，加入40mg的自由基引發劑偶氮二異丁腈，然后加入平均相對分子質量為6,000聚乙二醇20mg，再加入565μl二甲基丙烯酸乙二醇酯和229μl甲苯，超聲30分鐘，使各組分完全溶解混勻，得到一均相溶液，然后向該溶液中充氮氣，除去溶解在其中的氧氣，最后將溶液轉移至100mm×4.6mm不銹鋼管中，并封住不銹鋼管的兩端，將不銹鋼柱放入溫度55℃恒溫水浴中反應24小時；

b、將步驟a得到的不銹鋼柱從水浴鍋中取出，裝上柱頭，連接在高壓輸液泵上，分別以200ml四氫呋喃，體積比9:1的甲醇-乙酸200ml的溶液依次沖洗整體柱，流速為1.0ml/min，沖洗完畢后即可得到山萵苣苦素印跡整體柱。

用高效液相色譜法對山萵苣苦素分子印跡整體柱進行色譜性能評價：參數設置：紫外吸收波長256nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃，進樣體積20μl，用乙腈將山萵苣苦素分子印跡整體柱沖洗至基線水平，然后進樣，測定山萵苣苦素在印跡柱的保留時間tr，并用千分之一的丙酮來標定柱子的死時間t0，根據公式k’＝(tr-t0)/t0，計算得山萵苣苦素印跡因子達到1.54。

實施例6

原位聚合法制備山萵苣苦素分子印跡整體柱：

a、將山萵苣苦素和4-乙烯基吡啶按摩爾比1:60溶于2029μl濃度為40mg/ml含聚苯乙烯的四氫呋喃溶液中，其中聚苯乙烯的平均相對分子質量為350,000，加入40mg的自由基引發劑偶氮二異丁腈，然后加入平均相對分子質量為6,000聚乙二醇40mg，再加入565μl二甲基丙烯酸乙二醇酯和229μl甲苯，超聲30分鐘，使各組分完全溶解混勻，得到一均相溶液，然后向該溶液中充氮氣，除去溶解在其中的氧氣，最后將溶液轉移至100mm×4.6mm不銹鋼管中，并封住不銹鋼管的兩端，將不銹鋼柱放入溫度55℃恒溫水浴中反應24小時；

b、將步驟a得到的不銹鋼柱從水浴鍋中取出，裝上柱頭，連接在高壓輸液泵上，分別以200ml四氫呋喃，體積比9:1的甲醇-乙酸200ml的溶液依次沖洗整體柱，流速為1.0ml/min，沖洗完畢后即可得到山萵苣苦素印跡整體柱。

用高效液相色譜法對山萵苣苦素分子印跡整體柱進行色譜性能評價。參數設置：紫外吸收波長256nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃，進樣體積20μl。用乙腈將山萵苣苦素分子印跡整體柱沖洗至基線水平，然后進樣，測定山萵苣苦素在印跡柱的保留時間tr，并用千分之一的丙酮來標定柱子的死時間t0，根據公式k’＝(tr-t0)/t0，計算得山萵苣苦素印跡因子達到1.82。

實施例7

原位聚合法制備山萵苣苦素分子印跡整體柱：

a、將山萵苣苦素和4-乙烯基吡啶按摩爾比1:30溶于2029μl濃度為40mg/ml含聚苯乙烯的四氫呋喃溶液中，其中聚苯乙烯的平均相對分子質量為350,000，加入40mg的自由基引發劑偶氮二異丁腈，然后加入平均相對分子質量為6,000聚乙二醇20mg，再加入565μl二甲基丙烯酸乙二醇酯和229μl甲苯，超聲30分鐘，使各組分完全溶解混勻，得到一均相溶液，然后向該溶液中充氮氣，除去溶解在其中的氧氣，最后將溶液轉移至100mm×4.6mm不銹鋼管中，并封住不銹鋼管的兩端，將不銹鋼柱放入溫度55℃恒溫水浴中反應24小時；

b、將步驟a得到的不銹鋼柱從水浴鍋中取出，裝上柱頭，連接在高壓輸液泵上，分別以200ml四氫呋喃，體積比9:1的甲醇-乙酸200ml的溶液依次沖洗整體柱，流速為1.0ml/min，沖洗完畢后即可得到山萵苣苦素印跡整體柱。

用高效液相色譜法對山萵苣苦素分子印跡整體柱進行色譜性能評價。參數設置：紫外吸收波長256nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃，進樣體積20μl。用乙腈將山萵苣苦素分子印跡整體柱沖洗至基線水平，然后進樣，測定山萵苣苦素在印跡柱的保留時間tr，并用千分之一的丙酮來標定柱子的死時間t0，根據公式k’＝(tr-t0)/t0，計算得山萵苣苦素印跡因子達到1.66。

實施例8

原位聚合法制備山萵苣苦素分子印跡整體柱：

a、將山萵苣苦素和4-乙烯基吡啶按摩爾比1:120溶于2029μl濃度為40mg/ml含聚苯乙烯的四氫呋喃溶液中，其中聚苯乙烯的平均相對分子質量為350,000，加入40mg的自由基引發劑偶氮二異丁腈，然后加入平均相對分子質量為6,000聚乙二醇20mg，再加入565μl二甲基丙烯酸乙二醇酯和229μl甲苯，超聲30分鐘，使各組分完全溶解混勻，得到一均相溶液，然后向該溶液中充氮氣，除去溶解在其中的氧氣，最后將溶液轉移至100mm×4.6mm不銹鋼管中，并封住不銹鋼管的兩端，將不銹鋼柱放入溫度55℃恒溫水浴中反應24小時；

b、將步驟a得到的不銹鋼柱從水浴鍋中取出，裝上柱頭，連接在高壓輸液泵上，分別以200ml四氫呋喃，體積比9:1的甲醇-乙酸200ml的溶液依次沖洗整體柱，流速為1.0ml/min，沖洗完畢后即可得到山萵苣苦素印跡整體柱。

用高效液相色譜法對山萵苣苦素分子印跡整體柱進行色譜性能評價。參數設置：紫外吸收波長256nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃，進樣體積20μl。用乙腈將山萵苣苦素分子印跡整體柱沖洗至基線水平，然后進樣，測定山萵苣苦素在印跡柱的保留時間tr，并用千分之一的丙酮來標定柱子的死時間t0，根據公式k’＝(tr-t0)/t0，計算得山萵苣苦素印跡因子達到1.57。

實施例9

原位聚合法制備山萵苣苦素空白對照整體柱：

a、將1.0mmol的4-乙烯基吡啶106.5μl溶于2029μl濃度為40mg/ml含聚苯乙烯的四氫呋喃溶液中，其中聚苯乙烯的平均相對分子質量為350,000，加入40mg的自由基引發劑偶氮二異丁腈，然后加入0-40mg聚乙二醇，再加入565μl二甲基丙烯酸乙二醇酯和229μl甲苯，超聲30分鐘，使各組分完全溶解混勻，得到一均相溶液，然后向該溶液中充氮氣，除去溶解在其中的氧氣，最后將溶液轉移至100mm×4.6mm不銹鋼管中，并封住不銹鋼管的兩端，將不銹鋼柱放入溫度55℃恒溫水浴中反應24小時；

b、將步驟a得到的不銹鋼柱從水浴鍋中取出，裝上柱頭，連接在高壓輸液泵上，分別以200ml四氫呋喃，體積比9:1的甲醇-乙酸200ml的溶液依次沖洗整體柱，流速為1.0ml/min，沖洗完畢后即可得到山萵苣苦素空白對照整體柱。

用高效液相色譜法對山萵苣苦素空白對照整體柱進行色譜性能評價：參數設置：紫外吸收波長256nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃，進樣體積20μl，用乙腈將山萵苣苦素空白對照整體柱沖洗至基線水平，然后進樣，測定山萵苣苦素在空白對照整體柱的保留時間tr，并用千分之一的丙酮來標定柱子的死時間t0。根據公式k’＝(tr-t0)/t0，計算得山萵苣苦素在空白對照整體柱保留因子knip，山萵苣苦素在山萵苣苦素分子印跡柱保留因子為kmip，印跡因子通過公式if＝kmip/knip計算。

實施例10

山萵苣苦素分子印跡整體柱及其空白對照柱的選擇性能評價：

a、山萵苣苦素分子印跡整體柱選擇性能評價：設置紫外吸收波長256nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃，進樣體積20μl，用乙腈將山萵苣苦素分子印跡整體柱沖洗至基線水平，然后進樣山萵苣苦素類似物，得到山萵苣苦素類似物在印跡整體柱上的色譜圖，如圖2所示，山萵苣苦素分子印跡整體柱對山萵苣苦素的保留較強，可以實現山萵苣苦素與其結構類似物的有效分離；

b、空白對照柱選擇性能評價：設置紫外吸收波長256nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃，進樣體積20μl，用乙腈將山萵苣苦素空白對照整體柱沖洗至基線水平，然后進樣山萵苣苦素類似物，得到山萵苣苦素類似物在空白對照整體柱上的色譜圖，如圖3所示，空白對照整體柱柱不能實現山萵苣苦素與其結構類似物有效分離。