一種表面多孔型核殼結構硅膠微球及其制備方法和應用與流程

本發明涉及一種表面多孔型核殼結構硅膠微球及其制備方法及其色譜分離應用，屬于分析化學領域。

背景技術：

近年來，由固體核和表面多孔的殼組成的核殼結構色譜固定相被廣泛應用于高流速低壓色譜體系中。由于固體核表面多孔的外殼能夠增大固體核的尺寸，降低了柱壓，同時由于多孔的外殼材料增大了核的比表面積，從而提高色譜柱載樣量，如2.2μm核殼結構硅膠由0.5μm厚多孔的殼和1.7μm的核組成(g.guiochonandf.gritti,journalofchromatographya,2011,1218,1915-1938.)，能夠產生和2μm的粒子相同的柱效，同時柱壓又接近于裝填了3μm的硅膠微球填料的色譜柱的柱壓。因而，核殼結構的較小的孔隙體積能夠減少縱向擴散(即vandeemter方程中的b項)，同時，較短的擴散路徑能夠減小傳質阻力，從而減小vandeemter方程中的c項，因而對難以采用色譜分離的大分子化合物如蛋白質和多肽等生物大分子化合物具有較好的分離效果。

vandeemter方程：h＝a+b/u+cu

核殼結構中的核和殼可以是不同的材料或者相同的材料不同的結構組成，如圖所示，圖1為幾種不同的核殼結構粒子的示意圖，其中核可以是一個單獨的球(圖1(a))或者是幾個小球的合體(圖1(b))；核殼結構可能是含有一個中空的外殼和中間一個小球(圖1(c))，或像一個蛋黃-蛋殼的結構(圖1(c))；殼結構可以是一個連續層(圖1(c)和圖1(h))、一些更小的球吸附到一個大核表面(圖1(d)和圖1(e))或者核是由一群小核聚集合成(圖1(f))(x.l.zhang,h.y.niu,w.h.li,y.l.shiandy.q.cai,chemicalcommunications,2011,47,4454-4456.)。比較復雜的核殼結構是將一些更小的小球嵌入到殼里面(圖1(g))(x.y.lai,j.li,b.a.korgel,z.h.dong,z.m.li,f.b.su,j.a.duandd.wang,angewandtechemie-internationaledition,2011,50,2738-2741.)或者是由多層殼組成(圖1(i))(r.j.gui,a.wanandh.jin,analyst,2013,138,5956-5964.)，這些核和殼都由一個無孔的核和多孔的殼組成，核殼結構的材料被廣泛應用于色譜分離中，其中應用最多的基質填料是硅膠。不同孔徑大小的核殼結構可以用于分離不同大小的分析物，當核殼材料的孔徑在8-10nm之間，適合用于小分子化合物的分離(j.j.destefano,s.a.schuster,j.m.lawhornandj.j.kirkland,journalofchromatographya,2012,1258,76-83.)，孔徑更大的填料可用于分離更大相對分子質量的分子化合物。如孔徑16nm用于分離多肽和小分子蛋白質(mw<15kda)(j.j.kirkland,f.a.truszkowski,c.h.dilksandg.s.engel,journalofchromatographya,2000,890,3-13.)；更大孔徑的多孔材料，如孔徑40nm，可以允許大分子(mw<500kda)化合物能夠無限制地進入固定相，從而獲得較好的分離效果。

大部分核殼結構的硅膠材料是采用層層自組裝(lbl)的方法制備，特別是現在市場中商品化的核殼結構的硅膠(g.guiochonandf.gritti,journalofchromatographya,2011,1218,1915-1938.)。該方法利用正負電荷之間的靜電作用(或氫鍵作用、共價鍵、范德華力等)組裝成多層，具體方法為：硅膠核首先吸附一層帶電聚合物(如帶負電荷的硅膠能夠吸附帶正電荷的聚合物)，表面多余的帶電聚合物被水洗掉，這個包裹的核材料再浸潤在與帶電聚合物具有相反電荷的納米顆粒溶液中，從而再吸附一層殼。這個過程是交替重復沉浸在帶電聚合物溶液和納米顆粒的懸浮液中，直到形成所需厚度的殼(g.guiochonandf.gritti,journalofchromatographya,2011,1218,1915-1938.)；最后將形成的粒子采用高溫煅燒去除表面的有機聚合物，形成核殼多孔的材料。但是這種制備方法時間長，重現性差，因而需要找出一種制備簡單，方法可控，重現性更好的制備核殼型材料的方法。

技術實現要素：

為了克服現有技術中存在的技術難題，本發明提供一種操作簡單、應用廣泛的表面多孔的核殼固定相的制備方法及對上述表面多孔型核殼結構硅膠微球進行改性的方法，首先將在硅膠微球表面堆積h2sif6水解的納米氧化硅顆粒組成核殼型材料，再在該核殼材料表面進行功能化修飾，可以得到多種不同的色譜固定相。

本發明所提供的技術方案具體如下：

一種表面多孔型核殼結構硅膠微球，具有核殼結構，以粒徑為2～5μm的球形硅膠為核，以球形硅膠表面堆積的硅膠納米顆粒所形成的多孔殼狀結構為殼，核與殼緊密結合，殼的厚度為100-700nm，孔徑范圍為15-120nm。

一種表面多孔型核殼結構硅膠微球的制備方法，包括以下步驟：將粒徑為2～5μm的球形硅膠加入10體積份35wt％的h2sif6水溶液中，攪拌2～16h，其中，球形硅膠和h2sif6水溶液的用量比為1g：1ml；然后依次加入5體積份水和6體積份0.1mol·l^-1h3bo3水溶液，混合均勻；先將混合溶液在真空環境中靜置1h，再在40℃的恒溫搖床中振蕩12～24h，然后將反應后的混合溶液用沙芯漏斗過濾，過濾出的固體在120℃下烘干，再將烘干產物置于馬弗爐中，以140℃/min的速率升溫至200℃，保持2h，得到表面多孔型核殼結構硅膠微球，即sio2＠sio2。

一種對上述表面多孔型核殼結構硅膠微球進行改性的方法，包括以下步驟：將表面多孔型核殼結構硅膠微球置于反應釜中，加入8體積份硅烷偶聯劑和200體積份無水甲苯，在130℃下反應12h，冷卻至室溫后進行抽濾，然后依次用甲苯﹑丙酮、甲醇洗滌，45℃烘干，即得到表面修飾硅烷偶聯劑的表面多孔型核殼結構硅膠微球。

所述的硅烷偶聯劑為十八烷基三甲氧基硅烷或氨基丙基三甲氧基硅烷等硅烷偶聯劑。

一種表面修飾硅烷偶聯劑的表面多孔型核殼結構硅膠微球，由上述方法制備得到。

上述表面修飾硅烷偶聯劑的表面多孔型核殼結構硅膠微球用于蛋白質的分離或多肽的分離。

上述表面修飾硅烷偶聯劑的表面多孔型核殼結構硅膠微球作為色譜固定相的應用。

本發明具有以下優點和有益效果：

1.本發明制備方法簡單，制備時間短，方法可控(可以制備出不同孔徑不同厚度的多孔外殼)，重現性好。

2.本發明制備的核殼型硅膠應用性能好，可用于蛋白質、多肽等生物大分子化合物的分離，以及多種物質的快速色譜分離。

附圖說明

圖1是不同類型的核殼結構的示意圖；其中，圖1(a)表示核是一個單獨的球的核殼結構，圖1(b)表示核是幾個小球的合體的核殼結構；圖1(c)表示含有一個中空的外殼和中間一個小球的蛋黃-蛋殼核殼結構；圖1(d)和圖1(e)表示一些更小的球吸附到一個大核表面的核殼結構，圖1(f)表示核和殼均由一群小核聚集合成的核殼結構，圖1(g)表示將一些更小的小球嵌入到殼里面的復雜核殼結構，圖1(h)表示中空的核和連續的殼的核殼結構，圖1(i)表示具有多層殼的核殼結構。

圖2是粒徑為5μm球形硅膠和在40℃的恒溫搖床中振蕩24h所制備的殼厚度為0.48μm的sio2＠sio2的掃描電鏡(sem)圖；其中，圖2(a)是粒徑為5μm球形硅膠在放大1萬倍的sem圖；圖2(b)是粒徑為5μm球形硅膠放大5萬倍的sem圖；圖2(c)是殼厚度為0.48μm的sio2＠sio2放大1萬倍的sem圖；圖2(d)是殼厚度為0.48μm的sio2＠sio2放大5萬倍的sem圖。

圖3是粒徑為5μm球形硅膠和所制備的殼厚度為0.48μm的sio2＠sio2的透射電鏡(tem)譜圖；其中，圖3(a)是粒徑為5μm球形硅膠放大5萬倍的tem圖；圖3(b)是殼厚度為0.48μm的sio2＠sio2放大5萬倍的tem圖。

圖4為十八烷基鍵合sio2＠sio2分離5種蛋白質混合物的色譜分離圖。

圖5為十八烷基鍵合sio2＠sio2分離胰蛋白酶酶解的牛血清蛋白(bsa)的酶解物色譜分離圖。

具體實施方式

以下實施例為了使本領域普通技術人員更清楚地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。以下百分比若無特殊說明，均表示體積百分比。

實施例1

將10g粒徑為5μm的球形硅膠加入到10ml35wt％h2sif6水溶液中，攪拌2h；然后依次加入5ml水和6ml0.1mol·l^-1h3bo3溶液，混合均勻；先將混合溶液在真空環境中靜置1h，再在40℃的搖床中振蕩24h，然后將反應后的混合溶液用沙芯漏斗過濾，過濾出的固體在120℃下烘干，再將烘干產物置于馬弗爐中，以140℃/min的速率升至200℃，并保持2h，即得到表面多孔型核殼結構硅膠微球，即sio2＠sio2；

然后將制備的表面多孔型核殼硅膠置于反應釜中，再加入8ml十八烷基三甲氧基硅烷和20ml無水甲苯，在130℃溫度下反應12h，冷卻，抽濾，抽濾出的固體依次用甲苯﹑丙酮、甲醇洗滌，45℃烘干備用，即得到十八烷基鍵合sio2＠sio2。

實施例2

將10g粒徑為5μm的球形硅膠加入到10ml35wt％h2sif6水溶液中，攪拌16h；然后依次加入5ml水和6ml0.1mol·l^-1h3bo3溶液，混合均勻；先將混合溶液在真空環境中靜置1h，再在40℃的搖床中振蕩12h，然后將反應后的混合溶液用沙芯漏斗過濾，過濾出的固體在120℃下烘干，再將烘干產物置于馬弗爐中，以140℃/min的速率升至200℃，并保持2h，即得到表面多孔型核殼結構硅膠微球，即sio2＠sio2；

然后將制備的表面多孔型核殼硅膠置于反應釜中，再加入8ml氨基丙基三甲氧基硅烷和20ml無水甲苯，在130℃溫度下反應12h，冷卻，抽濾，抽濾出的固體依次用甲苯﹑丙酮、甲醇洗滌，45℃烘干備用，即得到氨基鍵合sio2＠sio2。

實施例3

將十八烷基鍵合sio2＠sio2裝填于50mm×4.6mm(i.d.)的液相色譜柱中，然后將其用于5種標準多肽樣品混合物(crgrgrgr-594.73kda,spvlaedpsegee-1269.21kda,cfrgl-594.73,cfrglrgfrg-1381.61,angitotensinⅱ-1046.18)的色譜分離，得到了很好的分離效果。

色譜條件：溶劑a為0.1％tfa水溶液，溶劑b為乙腈/0.1％tfa。流動相梯度程序為(t表示時間(min)，例如：t20表示進樣后20min時)：t0，20％b；t20，90％b；流速為0.2ml/min；樣品進樣量為20μl；檢測波長：215nm；柱溫：50℃。

實施例4

將十八烷基鍵合sio2＠sio2裝填于50mm×4.6mm(i.d.)的液相色譜柱中，然后將其用于5種標準蛋白質樣品混合物的色譜分離，得到了很好的分離效果，結果如圖3所示。

色譜條件：溶劑a為0.1％tfa水溶液，溶劑b為乙腈/0.1％tfa。流動相梯度程序為(t表示時間(min))：t0，25％b；t15，70％b；流速為0.2ml/min，樣品：5種蛋白質樣品(rnasea、cytochromec、bsa、myoglobin和carbonicanhydrase)；樣品進樣量為20μl；檢測波長：215nm。

實施例5

將十八烷基鍵合sio2＠sio2裝填于150mm×2.1mm(i.d.)的液相色譜柱中，然后將其用于胰蛋白酶酶解的牛血清蛋白(bsa)的酶解物色譜分離，得到了很好的分離效果，結果如圖4所示。

液相色譜條件：溶劑a為0.1％tfa水溶液，溶劑b為乙腈/0.1％tfa。流動相梯度程序為(t表示時間(min))：t0，10％b；t90，90％b；t120，10％b。流速為0.2ml/min，樣品：3pmolbsa酶解物；樣品進樣量為20μl。

質譜條件：質譜儀為德國布魯克公司的microtof-q質譜儀；質譜掃描模式：全掃描模式；掃描范圍m/z350-1500。

實施例6

將十八烷基鍵合sio2＠sio2裝填于50mm×4.6mm(i.d.)的液相色譜柱中，然后將其用于菲的保留分析，發現菲的容量因子k的lgk與流動相中甲醇含量成正比，表明其在該色譜柱上的保留主要基于疏水作用，且其保留機理不同于蛋白質等大分子樣品化合物的保留。

液相色譜條件：流動相分別為90％甲醇，80％甲醇，70％甲醇，60％甲醇和50％甲醇；流速為0.2ml/min；樣品進樣量為20μl；檢測波長：254nm。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。