一種用于生物/化學反應體系的反應裝置及其制備方法和應用與流程

本發明涉及一種用于生物/化學反應體系的反應裝置及其制備方法和應用，特別是涉及一種可用于多種生物/化學反應體系的微陣列芯片及其表面處理和應用。

背景技術：

微陣列芯片可以通過在固相支持介質上構建密集排列的二維點陣，實現對大批量樣品的高通量、原位分析，并可對生物/化學反應進行實時監測，在疾病監測、藥物篩選、理論研究等領域都有著重要的應用價值。具體來講，微陣列芯片可用于數字聚合酶鏈反應(dPCR)、藥物小分子與蛋白等生物樣品相互作用研究、單細胞分析等。

理想的可用于上述研究的微陣列芯片需要具有以下特點：(1)高通量，可單次實現大批量樣品的分析檢測；(2)芯片表面及反應位點表面對樣品無吸附，與樣品之間不會發生化學反應等相互作用；(3)芯片中各個反應位點之間獨立進行反應，各個反應之間不會產生交叉干擾等；(4)材料易得，制備方法簡單，成本低廉等。

但是，目前可用的微陣列芯片尚不能很好的滿足以上要求。以dPCR為例，它是一種核酸絕對定量技術，通過將微量樣品高倍稀釋和分液，使每個反應單元含有不超過一個模板分子，再將所有樣品進行PCR擴增，最后對結果以陽性或陰性直接計數統計分析。dPCR的出現，顯著推動了生命科學研究的進度，使得人們可以快速、高通量檢測病人樣本中致病基因的許多變化，具有廣闊的應用前景。同時，dPCR的推廣應用對其所用芯片的高通量、抗吸附、低干擾、低成本的要求非常高，而現有的技術仍然有很大的改進空間。因此，發展新型的微陣列芯片，使其滿足多種應用需求并且成本可控，對生命醫學的發展等有著非常重要的意義。

參考文獻1：CN104334273A公開了一種用于生物反應系統的包被的基體，其通過氣相沉積方法在基體以及反應位點上形成親水/疏水性涂層，或者直接的通過浸漬的處理，將清洗后的基體分次浸入不同親水/疏水性硅烷溶液中，從而賦予基體以及基體上的反應位點相同或不同的親水性/疏水性。盡管其由于基體和反應位點存在不同的前進角的特性使得進入反應位點的試劑能夠固定于反應位點的井或凹槽，避免相互交叉，串擾，但其生物反應芯片的整個制備過程相對復雜，尤其是使用氣相沉積技術直接對基體以及反應位點進行涂層沉積的操作具有安全隱患，控制工藝復雜，成本也相對高昂，且在直接浸漬的處理方式中可能存在形成涂層前基體表面或者反應位點活化程度不夠充分、均勻的擔憂。此外，將清洗后的基體直接使用浸漬的方法分次在基體表面以及反應位點形成不同親水性/疏水性涂層的方式，也存在基體表面以及反應位點的活化程度不足的擔憂，使得后續浸漬形成涂層的結合性不強，且分次浸入含有不同親水性/疏水性基體的溶液中，使得基體表面以及反應位點涂層材料相互干擾，對于基體和反應位點的接觸角的精確控制難度加大。

因此，探索一種高效、安全、低成本的生物反應微陣列芯片及其制備方法是十分必要的。發展新型的微陣列芯片，使其滿足多種應用需求并且成本可控，也對生命醫學的發展等有著非常重要的意義。

技術實現要素：

發明要解決的問題

本所要解決的技術問題為提供一種用于生物/化學反應體系的反應裝置，尤其是一種微陣列芯片，該裝置的基體以及反應位點表面具有親水性/憎水性表面層，且這些表面層與基體以及反應位點的結合性得到改善，從而得到更加精確控制的親/疏水性。

本發明所要解決的另外的技術問題在于提供一種高效、安全、低成本的生物反應裝置--尤其是生物反應微陣列芯片的制備方法。

具體的，使用等離子體對形成有反應位點的生物反應裝置或生物反應微陣列芯片的進行活性處理，該種活化方式中等離子體能夠對金屬、氧化物和大多數高分子材料形成的基體進行活化處理，其能夠使得基體以及位于基體的反應位點充分的活化或官能化。

用于解決問題的方案

本發明用于解決以上技術問題的技術方案為：

[1].一種用于生物/化學反應體系的反應裝置，所述反應裝置包括基體以及在基體上形成的反應位點，其特征在于，所述基體的材料選自金屬、陶瓷、石英或聚合物材料，在所述基體表面以及反應位點表面形成有表面層，所述基體表面的表面層具有接觸角為α，所述反應位點的表面層具有接觸角為β，所述基體表面以及反應位點表面在形成表面層前經過等離子體進行表面處理，所述反應位點的表面層具有親或疏水性。

[2].根據[1]所述的反應裝置，其特征在于，所述等離子體進行表面處理中使用氧等離子體。

[3].根據[1]或[2]所述的反應裝置，其特征在于，所述基體表面的表面層的接觸角α大于或等于反應位點的表面層的接觸角β，優選基體表面的表面層的接觸角α與所述反應位點的表面層的接觸角β的差值大于等于0°，小于等于65°。

[4].根據[1]-[3]任一項所述的反應裝置，其特征在于，所述基體表面的表面層的接觸角α范圍為75°≤α≤125°，優選為80°≤α≤110°，更優選為85°≤α≤100°。

[5].根據[1]-[4]任一項所述的反應裝置，其特征在于，所述反應位點形狀為圓形、橢圓形、多邊形或它們的組合，和/或在每個反應位點所加載的液體樣品體積為100納升以下。

[6].根據[5]所述的反應裝置，其特征在于，所述反應位點以通孔、或通孔與凹槽混合的形式存在于所述基體。

[7].根據[1]-[6]任一項所述的反應裝置，其特征在于，所述反應位點在加載液體樣品時，占反應位點總數的90-100％的反應位點被加載。

[8].根據[1]-[7]任一項所述的反應裝置，其特征在于，所述生物/化學反應為擴增反應或小分子與蛋白相互作用、分子與單細胞相互作用等。

[9].一種用于生物/化學反應體系的反應裝置的制備方法，其特征在于，所述方法包括：a)準備基體的步驟，所述基體的材料選自金屬、陶瓷、石英或聚合物材料，所述基體上形成有反應位點；b)使用等離子體對基體以及反應位點進行表面處理的步驟；c)在基體表面、反應位點形成表面層的步驟；所述基體表面的表面層具有接觸角為α，所述反應位點的表面層具有接觸角為β，所述反應位點的表面層具有親或疏水性。

[10].根據[9]所述的反應裝置的制備方法，其特征在于，所述方法包括：所述a)步驟包括清洗所述基體的步驟。

[11].根據[10]所述的反應裝置的制備方法，其特征在于，所述清洗所述基體的步驟包括將形成反應位點后的基體用水、丙酮等超聲清洗。

[12].根據[9]-[11]任一項所述的反應裝置的制備方法，其特征在于，所述b)步驟包括，使用氧等離子體對基體以及反應位點進行表面處理的步驟。

[13].根據[9]-[12]任一項所述的反應裝置的制備方法，其特征在于，所述c)步驟包括，在基體的表面以及反應位點的表面同時形成表面層的步驟C1)。

[14].根據[13]所述的反應裝置的制備方法，其特征在于，所述C1)步驟包括，將基板浸入溶液中10-60分鐘，所述溶液包含硅烷化合物，以及它們的衍生物，優選包含三甲氧基硅烷類化合物，更優選為正丙基三甲氧基硅烷。

[15].根據[14]所述的反應裝置的制備方法，其特征在于，所述溶液的配制方法為：將鹽酸水溶液和所述硅烷試劑混合攪拌30-40分鐘，所述鹽酸水溶液的pH值為4-6。

[16].根據[9]-[12]任一項所述的反應裝置的制備方法，其特征在于，所述c)步驟包括，分別在基體表面形成表面層的步驟以及在反應位點形成表面層的步驟，所述基體表面的表面層具有接觸角為α，所述反應位點的表面層具有接觸角為β，且α≥β。

[17].根據[1]-[16]任一項所述的反應裝置的制備方法，其特征在于，所述方法包括：在基體表面、反應位點形成表面層后的后處理步驟d)，所述后處理步驟包括，用丙酮沖洗基體，烘干40-60分鐘，然后用水振蕩清洗基體，氮氣吹干。

[18].根據[17]所述的反應裝置的制備方法，其中所述的烘干的溫度為100-120℃。

[19].根據[1]-[9]任一項所述的反應裝置或者根據[10]-[18]任一項所述制備方法得到的反應裝置的用途，其特征在于，用于生物或化學反應，包括但不局限于：擴增反應、小分子與蛋白相互作用、分子與單細胞相互作用。

發明的效果

本發明使用等離子體處理生物/化學反應裝置，將生物反應芯片基體以及位于基體的反應位點使用等離子處理手段進行表面功能化，然后在所述基體以及所述反應位點形成表面層，所述基體的材料選自金屬、陶瓷、石英或聚合物材料。這樣形成的表面層與所述基體、反應位點結合能力增強。

本發明的效果還在于，所述基體表面的表面層具有接觸角為α，所述反應位點的表面層具有接觸角為β，且α≥β，使得進入反應位點的樣品被固定于范圍位點之內，避免相互交叉，串擾，提高信號的可識別性。

此外，本發明的效果還在于，省略了氣相沉積等較為昂貴、危險的工藝過程，同時，也避免了使用不同親/疏水性硅烷原料分別形成基體的表面層、反應位點的表面層時反復的清洗工藝，提高了對基體的表面層、反應位點的表面層親/疏水性的控制精度。

附圖說明

圖1：生物反應芯片局部的正面(上)，及側切面(下)示意圖。

圖2.：生物反應芯片的主要制作流程。

具體實施方式

為了提供對本發明更充分的理解，以下描述列舉了很多具體細節如具體結構、參數、實例等。然而，應認識到這樣的描述并非旨在限制本發明的范圍，而是旨在提供對示例性實施方案的更好描述。

本發明的目的在于提供一種可用于多種生物/化學反應裝置，特別是微陣列芯片的設計以及制備方法和用途。通過特定的芯片設計及對芯片的基體和反應位點的表面處理，使得所述微陣列芯片具有高通量、抗吸附、低干擾等優勢，為數字聚合酶鏈反應、藥物篩選、腫瘤標志物檢測等提供良好的操作平臺。

所述反應裝置包括基體和在所述基體中的多個微陣列式反應位點；所述芯片的基體表面及所述微陣列式反應位點的表面根據反應體系的要求可被修飾為具有特定親水/疏水等性質的表面，以便將特定體積的反應體系引入到反應位點中，減少基體表面對反應體系樣品的不必要的吸附，并避免交叉干擾。每個反應位點中的反應體系基本被局限于各自的反應位點中，獨立進行生物或化學反應。

基體

所述的基體可以由以下材料之一組成：金屬、陶瓷、石英或聚合物材料。進一步，為了更好的適應后續的等離子處理的表面活化，優選金屬或者聚合物材料所形成的基體，特別的優選聚合物材料形成的基體。

反應位點

所述的多個微陣列反應位點可以為上下通透小孔或不通透小槽，形狀可以為圓形、正多邊形、或其它可以形成緊密排列的形狀，每個反應位點可容納的反應體系的體積例如為100納升以下，或50納升以下，或20納升以下，或2納升以下，或1納升以下，在一些情況中至多為0.5納升，數目至少為10000個。

所述反應位點的形成方式沒有特別的限定，可以為本領域常規的刻蝕技術等。

通常認為，減少反應體積可允許更高密度的反應體積，從而可在給定的區域內進行更多的反應。例如，基體上由300μm直徑的通孔組成的陣列可含有約30nL的反應體積。例如，通過將陣列中每個通孔的大小降低至直徑60-70μm，每個反應體積可為100pL。根據本文描述的各種實施方案，反應體積的范圍可為約1pL至40nL。在一些實施方案中，反應位點陣列可由各種不同體積的反應區域組成以增加動態范圍。

所述的多個微陣列反應位點可以通過濕法刻蝕或干法刻蝕設計制備。

本發明提供了可用樣品體積充分加載的裝置。基體特定區域的表面特性如疏水性和/或親水性可有助于將液體樣品加載至反應位點。如上所述，疏水性/親水性的水平可基于影響加載基體的多個反應位點的便利性和效率的各種因素。

例如，影響反應位點加載的一個因素為反應位點的物理幾何形狀，并且/或者基體可能有助于加載所述樣品。例如基于反應位點深度(芯片厚度)和反應位點直徑的反應位點之間的縱橫比，可為確定充分加載所述反應位點所需特性的因素。反應位點深度(芯片厚度)與直徑的比率被稱為縱橫比。例如，如果反應位點深度等于反應位點直徑，則縱橫比為1。在另一實例中，當反應位點深度為反應位點直徑的10倍時，縱橫比為10。應位點的直徑影響毛細管力，其使得能夠/有助于用液體反應媒介加載反應位點。在一些實施方案中，直徑越小，毛細管力越大，且更利于/便于加載反應位點。

根據各種實施方案，影響用樣品體積加載反應位點的另一因素為期望的加載效率和/或一致性。期望的效率是大于或等于90％的反應位點被加載。在其他實施方案中，期望的效率可為90％的反應位點被加載，且反應位點之間的差異最多為10％。

根據各種實施方案，影響用樣品體積加載反應位點的另一因素為在反應位點內材料與期望的反應的相容性。在一些實施方案中，所述期望的反應可為擴增反應。更具體地，所述擴增反應可為數字聚合酶鏈式反應(dPCR)。根據各種實施方案，裝置接觸例如參與反應的樣品體積、酶或試劑的部分，不應該與樣品體積、酶或試劑發生化學相互作用。例如，接觸反應的材料不應該將可能干擾反應的離子泄露到所述反應位點。根據各種實施方案，影響加載反應位點的又一因素為被加載至反應位點后所需的樣品體積的限制。換句話說，需要有足夠的力來防止從每個反應位點泄漏樣品體積，以防止從一個反應位點溢出至另一反應位點，并防止樣品體積在反應位點外的任何積聚。

等離子處理方法

等離子，即物質的第四態，是由部分電子被剝奪后的原子以及原子被電離后產生的正負電子組成的離子化氣狀物質。它的能量范圍比氣態、液態、固態物質都高，存在具有一定能量分布的電子、離子和中性粒子，在與材料表面的撞擊時會將自己的能量傳遞給材料表面的分子和原子，產生一系列物理和化學過程。其作用在物體表面可以實現物體的超潔凈清洗、物體表面活化、蝕刻、精整以及等離子表面涂覆。

本發明中，所述的基體表面和反應位點表面可以通過等離子體處理進行表面活化，所述活化是使用等離子體的濺射或注入使得基材表面獲得所期望的活性基團。

具體的，本發明中使用氧等離子體對基體進行表面處理，能夠使得基體以及基體中反應位點獲得所期望的活性基團，從而為后續的基體表面層、反應位點的表面層的形成提供改善的結合力。

更具體的，使用含氧等離子體對芯片進行處理，在一些實施方式中，例如，用低溫氧等離子體方法對基體材料進行處理，通過掃描電鏡、紅外光譜和光電子能譜綜合分析結果表明，基體以及反應位點表面含有表面上產生了-OH、-COOH和CO等極性基團，一方面使得被處理的材料的各暴露面具有親水性，特別的，使得在后續的基體以及反應位點表面層形成時，提供基體材料與表面層更緊固的結合。

有機硅烷

本發明在反應裝置，尤其是生物化學反應芯片的基體表面以及反應位點所形成的表面層由各種有機硅烷形成。

有機硅烷上取代基性質的不同，有機硅烷包括了親水性有機硅烷以及憎水性有機硅烷。因此，使得不同類型的有機硅烷進行表面處理使得精確控制反應裝置基體表面以及反應位點的親/疏水性成為可能。

本發明中使用的有機硅烷包括：烷基-三甲氧基硅烷、烷基-三乙氧基硅烷、烷基-二甲氧基單甲基硅烷、烷基-二乙氧基單甲基硅烷、烷基-單甲氧基二甲基硅烷、烷基-單乙氧基二甲基硅烷、(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷、或者其他硅烷、硅氧烷。

在本申請的一種實施方案中，可以采用如下步驟：

(1)將打孔后的基體用水或丙酮超聲清洗后，再用氧等離子體處理；

(2)將處理后的基體浸入配置好的硅烷溶液中10-30分鐘；

(3)然后用丙酮沖洗基體，高溫烘干40-60分鐘；

(4)用水振蕩清洗基體，氮氣吹干。

所述的硅烷溶液的配制方法為：將體積分數為0.1-0.2mol/L的鹽酸水溶液和所述的硅烷試劑混合攪拌30-40分鐘，所述的硅烷試劑可以為三甲氧基硅烷，優選為正丙基三甲氧基硅烷，所述鹽酸水溶液的pH值為4-6。

通過該實施方式所得到微陣列芯片的基體表面以及反應位點的表面層具有相同的親疏水性質。根據本文教導的這種實施方案，基體表面部分的涂層具有疏水特性，且反應位點表面的部分的表面層具有疏水特性。盡管兩種表面均具有疏水特性，所述反應位點可通過例如毛細管作用來加載。當然，作為上述實施方式的并列方式，取決于使用的硅烷的種類的不同，也可以通過本領域技術人員所熟知的常規的調整，在基體表面和反應位點表面形成親水性的涂層。

本發明的第二實施方式中，采用如下步驟：

(1)將打孔后的基體用水或丙酮進行超聲清洗后，再用氧等離子體處理；

(2)對基體表面以及反應位點分別地形成表面層的步驟；

(3)然后用丙酮沖洗基體，高溫烘干40-60分鐘；

(4)用水振蕩清洗基體，氮氣吹干。

在該種實施方式中，第(2)步驟中，包括在基體表面形成表面層的步驟。

具體的，將使用氧等離子體處理過的基體中的通孔或凹槽形式的反應位點預先導入鹽酸溶液，作為保護。然后將該基體進入包含有有機硅烷S1的有機溶劑中，所述有機溶劑為不于水混溶的有機溶劑，這樣確保包含有S1的有機溶劑不進入反應位點。所述有機溶劑可以為各種烴類溶劑，優選為戊烷、庚烷或己烷等。由于基體經過氧等離子體處理，使得表面具有羥基等活性基團的基體與S1進行反應，S1均勻的覆蓋于基體表面，形成表面層。

第(2)步驟中，還包括在反應位點表面形成表面層的步驟。

具體的，在基體表面形成表面層后，進而將與S1反應完畢的基體浸入到包含有有機硅烷S2的水性溶劑中，所述有機硅烷S2為親水性有機硅烷，所述有機溶劑可以為，乙腈、乙醇、甲醇、酮類等。典型的，S2可以采用雙功能化的硅烷(烷氧基和環氧基)來實現，即S2可以與反應位點上剩余的(即以上所提及的鹽酸溶液保護而為被反應的)羥基進行反應，其烷氧基結合至水化的基體。

進過以上步驟，使得基體的表面以及反應位點分別形成有表面層，所述基體表面的表面層具有接觸角為α，所述反應位點的表面層具有接觸角為β，且α≥β。

需要說明的是，在這樣的實施方式中，由于基體預先經過氧等離子處理，在形成反應位點的表面層前，基體表面由于被活化或官能化，使之能夠與S1表示的有機硅烷充分、均勻的反應形成連續的表面層。因此，在后續的使用浸漬方法在反應位點形成表面層時，基體表面沒有明顯剩余的羥基等極性基團，防止了基體表面與S2的反應或結合，即基體表面的表面層不會被S2所干擾。這樣，在一些情況中，如需要得到不同親/疏水性質表面層的情況下，可以實現精確的控制基體體表面的表面層與反應位點的表面層的親/疏水性，而不必擔憂或實施對基體表面親/疏水性的二次調節或修飾。

進一步，在第二實施方式中，可任選的，所述步驟(2)在使用S2形成反應位點表面層后可以進一步使得所述S2中環氧丙基與各種分子量的聚乙二醇、聚乙烯醇或聚丙烯醇反應進行親水性修飾。

本發明所述的可用于生物或化學反應體系包括但不局限于：擴增反應、小分子與蛋白相互作用、分子與單細胞相互作用等。

所述的基體表面和反應位點表面修飾后有助于將特定體積的反應體系引入到反應位點中，減少基體表面和反應位點表面對反應體系樣品的吸附，并避免交叉干擾。

所述的每個反應位點中的反應體系基本被局限于各自的反應位點中，獨立進行生物或化學反應。

與現有技術相比，本發明至少具有以下優點：

(1)所述微陣列芯片可用于多種生物/化學體系，具有一定的通用性；

(2)特別是氣相沉積等方法相比，本發明所述微陣列芯片的基體及表面修飾材料價格便宜，成本低廉，易于推廣，且制備過程安全，簡單，可控性高。此外本發明也能夠避免不必要的二次修飾；

(3)所述微陣列芯片同時具有高通量、抗吸附、低干擾的特點，對提高研究結果的準確度與精密度有很大的幫助。

實施例

以下基于實施例對本發明進行更詳細的說明。但是本發明不被以下的實施例任何限定，在不變更其主旨的范圍內能夠適當變更來實施。

實施例1

微陣列芯片的制備：

(1)取得微陣列芯片用基體，進行打孔作業，打孔后結束后，依次用清潔劑、丙酮、水超聲分別清洗10min；

(2)將清洗干凈的基體置于等離子體發生器中，采用氧等離子體處理80s，控制等離子發生器的功率為60W；

(3)將氧等離子體處理后的基體取出，并迅速浸入配置好的硅烷溶液中浸泡25分鐘；

(4)將浸泡后的基體去除，然后用丙酮反復沖洗基體，再置于100℃烘箱中高溫烘干50分鐘；

(5)用水振蕩清洗基體，氮氣吹干。

所述的硅烷溶液的配制方法為：將鹽酸水溶液和所述的硅烷試劑混合攪拌30分鐘，所述的硅烷試劑為三甲氧基硅烷，所述鹽酸水溶液的pH值為4。

實施例2

微陣列芯片的制備：

(1)取得微陣列芯片用基體，進行打孔作業，打孔后結束后，依次用清潔劑、丙酮、水超聲分別清洗10min；

(2)將清洗干凈的基體置于等離子體發生器中，采用氧等離子體處理85s，控制等離子發生器的功率為60W；

(3)將氧等離子體處理后的基體取出，并迅速浸入配置好的硅烷溶液中浸泡25分鐘；

(4)將浸泡后的基體去除，然后用丙酮反復沖洗基體，再置于100℃烘箱中高溫烘干60分鐘；

(5)用水振蕩清洗基體，氮氣吹干。

所述的硅烷溶液的配制方法為：將鹽酸水溶液和所述的硅烷試劑混合攪拌40分鐘，所述的硅烷試劑為正丙基三甲氧基硅烷，所述鹽酸水溶液的pH值為5。

產業上的可利用性

本發明的技術方案可以應用于工業生產，用于制備生物/化學反應芯片，具體來講，本發明的微陣列芯片可用于數字聚合酶鏈反應(dPCR)、藥物小分子與蛋白等生物樣品相互作用研究、單細胞分析等。