磁性金納米顆粒修飾的毛細管色譜柱制備方法與流程

本發明涉及一種毛細管電色譜技術領域，具體涉及一種磁性金納米顆粒修飾的毛細管電色譜柱制備方法。

背景技術：

毛細管電色譜是用電滲流或電滲流結合壓力流來推動流動相的一種液相色譜法，其以內含色譜固定相的毛細管為分離柱，兼具毛細管電泳及高效液相色譜的雙重分離機理，既可分離帶電物質也可分離中性物質。毛細管電色譜技術是近年來發展十分迅速的高效、快速微分離技術，其使用的毛細管電色譜柱是毛細管電色譜技術的核心，因此，新型色譜柱的創新開發一直是本領域長期關注和探索的熱點。

根據制備方法不同，毛細管色譜柱分為填充柱、整體柱、開管柱。填充柱即填充了固定相的色譜柱，填充柱制備簡單，可供選用的載體、固定液、吸附劑種類很多，因而具有廣泛的選擇性，有利于解決各種各樣組分的分離分析問題，應用比較普遍，但填充柱的樣品負荷量大，可用于制備色譜其缺點是柱滲透性較小，傳質阻力較大，柱子不能過長，因而分離效率較低，不能廣泛推廣應用。整體柱，是一種用有機或無機聚合方法在色譜柱內進行原位聚合的連續床固定相，在毛細管電色譜中使用整體色譜柱可以避免了塞子的制作難題，并排除了由塞子產生氣泡的煩惱，具有較廣泛的應用。開管柱因其無填充固定相，沒有渦流擴散，分離效率高，分離時間短。由于開管柱不需要燒結柱塞，其制備過程簡單，操作方便等優點引起人們的廣泛關注。但正是由于開管柱不含有填充固定相，導致其phase ratio(存在相比)較低、柱容量較小，限制了它在電色譜分離方面的應用范圍。

納米材料是一類粒徑大小分布在1～100nm范圍的微小材料，具有比表面積大、催化性能獨特、生物兼容性好等特點，將其應用于開管柱的制備，能夠有效地改善相比低和柱容量小的缺點，在電色譜領域引起廣泛的研究興趣。近年來，用作開管柱固定相的納米材料有多種，如有機物納米(殼聚糖等)、硅納米(二氧化硅)、碳納米(石墨烯、氧化石墨烯等)、金屬納米(金、銀、二氧化鈦等)等。其中，金納米材料，除了比表面積大、生物兼容性好等優點外，還具有原料易得、粒徑大小可調、表面易修飾等優點。金屬納米材料通過巰基、氨基等作為連接臂可以修飾鏈接各種功能性基團，如環糊精、BSA蛋白等，因此將其用于色譜固定相將有很大的潛力。

近年來，將金屬納米材料應用于開管柱制備的例子相繼被報道。通常的方法是通過化學鍵合或者物理吸附將金屬納米材料固定到經過修飾的毛細管內壁。以金納米材料為例，有文獻報道Glennon等在酸堿預處理毛細管內壁后用APTMS(3-氨丙基三甲氧基硅烷)或MPTMS(3-巰丙基三甲氧基硅烷)修飾毛細管內壁，最后將金納米固定到毛細管的內壁。也有文獻報道Rezanka用MPTMS/EtOH/HCl＝7/2/1攪拌24小時制得的溶膠凝膠預處理毛細管內壁，然后再將金納米固定到的毛細管內壁。還有文獻報道瞿等用聚二甲基二烯丙基氯化銨、聚苯乙烯磺酸鈉、聚二甲基二烯丙基氯化銨聚合物涂層的方法層層組裝將毛細管內壁修飾成帶正電，然后利用離子吸附將負電性的金納米吸附到毛細管內壁。

但上述將金屬納米材料通過化學鍵合或者物理吸附的方法固定到毛細管內壁，制備過程都較為繁瑣。不僅制備成本較高不利于推廣使用，而且通過物理方法吸附納米材料牢固性較弱，會進一步影響后期毛細管色譜柱的分離效率和使用壽命。因此，一種操作簡單，原料易得，同時使得毛細管電色譜柱使用壽命較長的金納米修飾毛細管電色譜柱的制備方法亟待出現。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明目的是為了解決上述技術問題，提供了一種操作簡單、原料易得、使用壽命較長的磁性金納米顆粒修飾的毛細管電色譜柱的制備方法。為了達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種磁性金納米顆粒修飾的毛細管色譜柱制備方法，包括毛細管預處理步驟、磁性金納米顆粒分散液制備步驟、毛細管色譜柱制備步驟，所述毛細管色譜柱制備步驟包括下述方法：

Step1，在經毛細管預處理步驟處理后的毛細管外周圍固定永磁鐵，為毛細管周圍提供一外加磁場；

Step2，將磁性金納米顆粒分散液制備步驟所制得的磁性金納米顆粒分散液以10～50ul/min流速從毛細管一端充入毛細管內，保持磁性金納米顆粒分散液在毛細管內5～15min，之后將磁性金納米顆粒分散液流出毛細管，即得到所述磁性金納米顆粒修飾的毛細管色譜柱。

本發明進一步地，所述磁性金納米顆粒分散液包括Au-Fe_xO_y納米顆粒的分散液，其中，x、y是符合化學電子式結構的自然數。

本發明進一步地，所述Au-Fe_xO_y納米顆粒包括Au-Fe₂O₃納米顆粒、Au-Fe₃O₄納米顆粒或Au-FeO納米顆粒。

本發明進一步地，所制得的Au-Fe_xO_y納米顆粒表面包括修飾其的手性基團、環糊精或蛋白質。

本發明進一步地，所述Au-Fe_xO_y納米顆粒的粒徑范圍在12～25nm。

本發明進一步地，所述Au-Fe₃O₄納米顆粒，其分散液的制備包括下述方法，將0.2mmol TBAB催化劑催化還原0.1mmol HAuCl₄.4H₂O得Au納米溶膠，將所制得0.1mmolAu納米溶膠溶于5mL十八烷氧乙醇中，升溫至320℃反應30min，制得Au-Fe₃O₄納米顆粒，將Au-Fe₃O₄納米顆粒分散到正己烷得Au-Fe₃O₄納米顆粒分散液。

本發明進一步地，所述Au-Fe_xO_y納米顆粒或表面修飾的Au-Fe_xO_y納米顆粒的結構包括Janus結構或花狀結構。

本發明進一步地，所述Janus結構包括啞鈴型結構。

本發明進一步地，所述毛細管預處理步驟包括下述方法，先用去離子水沖洗毛細管5～20min，接著用NaOH溶液沖洗毛細管3～5h，再用去離子水沖洗5～30min。

本發明進一步地，重復所述Step2步驟，以得到所需吸附磁性金納米顆粒厚度的毛細管色譜柱。

通過上述技術方案，本發明技術方案的有益效果是：采用磁性固定的方法，將磁性金納米顆粒，尤其是Au-Fe_xO_y納米顆粒在外加磁場輔助下固定到毛細管內壁，避免了化學鍵合方法的繁瑣和動態涂敷的方法，改善毛細管色譜柱壽命短等不足，該方法所使用的原料易得，操作簡便、穩定，制得的毛細管色譜柱的使用壽命較長。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1A為本發明實施例1的Au納米顆粒的SEM圖；

圖1B為本發明實施例1的和Au-Fe₃O₄納米納米顆粒的SEM圖；

圖2為本發明實施例1制得的Au-Fe3O4納米電色譜柱與Fe3O4納米電色譜柱和空管柱對硫脲、萘和聯苯的電色譜模式的分離對比圖；

圖3為本發明實施例1的三種同分異構體的分離電色譜圖；

圖4為本發明實施例1的雞蛋白中蛋白質分離電色譜圖。

具體實施方式

本發明公開了一種磁性金納米顆粒修飾的毛細管色譜柱制備方法，該方法所使用的原料易得，操作簡便、穩定，制得的毛細管色譜柱的使用壽命較長。下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行 清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明磁性金納米顆粒修飾的毛細管色譜柱制備方法，包括毛細管預處理步驟、磁性金納米顆粒分散液制備步驟、毛細管色譜柱制備步驟。本發明創造的要旨主要在于毛細管色譜柱制備步驟，該步驟包括下述方法：

Step1，在經毛細管預處理步驟處理后的毛細管外周圍固定永磁鐵，為毛細管周圍提供一外加磁場；

Step2，將磁性金納米顆粒分散液制備步驟所制得的磁性金納米顆粒分散液以10～50ul/min流速從毛細管一端充入毛細管內，保持磁性金納米顆粒分散液在毛細管內5～15min，之后將磁性金納米顆粒分散液流出毛細管，即得到所述磁性金納米顆粒修飾的毛細管色譜柱。

作為本發明提供的磁性金納米顆粒分散液，包括但不限制于Au-Fe_xO_y納米顆粒的分散液，本領域技術人員公知的可使Fe_xO_y為媒介固定的金屬材料的磁性金納米顆粒均屬于本發明要旨。對于上述Au-Fe_xO_y納米顆粒，具體地，x、y是符合化學電子式結構的自然數。優選Au-Fe₂O₃納米顆粒、Au-Fe₃O₄納米顆粒或Au-FeO納米顆粒。Au-Fe_xO_y納米顆粒的粒徑范圍在12～25nm，更有利于本發明磁固定方法將Au-Fe_xO_y納米顆粒固定在毛細管內。

作為本發明提供的Au-Fe_xO_y納米顆粒，其表面包括對其修飾的手性基團、環糊精或蛋白質。如Au-Fe₃O₄納米顆粒表面可用牛血清蛋白修飾，表示為Au-Fe₃O₄-BSA。本發明所提供的Au-FexOy納米顆粒、或表面修飾的Au-Fe_xO_y納米顆粒具有特殊的結構，以利于外加磁場對其磁固定。上述Au-Fe_xO_y納米顆粒、或表面修飾的Au-Fe_xO_y納米顆粒的結構包括但不限制于Janus結構或花狀結構。其中，Janus結構優選于啞鈴型結構。

本發明所提供的磁性金納米顆粒分散液，其制備步驟以Au-Fe₃O₄納米顆粒分散液的制備為例進行說明。本發明所述磁性金納米顆粒分散液包括但不 限于Au-Fe₃O₄納米顆粒分散液，也包括以Fe_xO_y為媒介固定的其他金屬材料的磁性金納米顆粒分散液。但本發明提供的Au-Fe₃O₄納米顆粒分散液的制備方法，由于其采用的原料、催化劑和助劑，操作易進行，磁性金納米顆粒分散效果更好。具體地，將0.2mmol TBAB催化劑催化還原0.1mmol HAuCl₄.4H₂O得Au納米溶膠，將所制得0.1mmolAu納米溶膠溶于5mL十八烷氧乙醇中，升溫至320℃反應30min，制得Au-Fe₃O₄納米顆粒，將Au-Fe₃O₄納米顆粒分散到正己烷得Au-Fe₃O₄納米顆粒分散液。

本發明所提供的毛細管預處理步驟，更有利于后續磁固定制備毛細管色譜柱。具體包括：先用去離子水沖洗毛細管5～20min，接著用NaOH溶液沖洗毛細管3～5h，再用去離子水沖洗5～30min，即得到處理后的毛細管。

本發明為了得到符合規格的毛細管色譜柱，可以不斷地重復上述Step2步驟，以得到所需吸附磁性金納米顆粒厚度、即磁性金納米顆粒涂層厚度的毛細管色譜柱。即根據實際分離的需求，根據磁性金納米顆粒涂層所需厚度、時間不同重復step2步驟，方便的調整Au-Fe₃O₄納米厚度，及調整表面活性修飾進而調整色譜柱的表面性能，以此得到符合規格的毛細管電色譜柱。具體實施例如下：

【實施例1】

Au-Fe₃O₄磁性金納米顆粒修飾的毛細管色譜柱的制備方法，步驟包括如下：

(1)毛細管的預處理。用甲醇沖洗毛細管10min，接著用NaOH溶液沖洗毛細管1h，再用去離子水沖洗10min。

(2)按照上述本發明提供的磁性金納米顆粒分散液制備方法制得2mg/ml Janus結構的Au-Fe₃O₄納米/正己烷溶液。

(3)Au-Fe₃O₄納米修飾毛細管柱的制備。將處理好的毛細管用一定40cm的永磁鐵固定，提供一個外加磁場，用微流注射泵將帶磁性的2mg/ml Au-Fe₃O₄環已烷溶液以15ul/min的流速充入毛細管內，并保持15min。最終 用10mM磷酸鈉緩沖溶液沖洗毛細管10min，即得到Au-Fe₃O₄納米修飾的毛細色譜柱。

將實施例1制得的毛細管色譜柱進行性能測試，如下所示：

如圖1A和圖1B所示，在透射電子顯微鏡下觀察其結構，分別為Au納米顆粒的SEM圖和Au-Fe₃O₄納米納米顆粒的SEM圖。

如圖2所示，通過本技術方案制得的Au-Fe₃O₄納米電色譜柱(以C曲線表示)，以pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液/甲醇(55∶45，v/v)為流動相，分離電壓為-20kV的條件下，實現硫脲1、萘2和聯苯3的分離，并在此基礎上比較了同樣方法制得的Fe₃O₄納米電色譜柱(B曲線表示)和空管柱(A曲線表示)無明顯的分離能力。同時實驗顯示run-to-run(n＝6)、day-to-day(n＝5)、column-to-column(n＝5)重復性RSD值分別為0.34％、0.96％、1.75％，說明本發明制備得到的毛細管色譜柱有很好的穩定性。

如圖3所示，再以通過本技術方案制得的Au-Fe₃O₄磁性金納米顆粒修飾的毛細管色譜柱為電色譜柱，采用毛細管電色譜柱分離模式，以10mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 9.0)為流動相，分離電壓為-20kV的條件下，實現了鄰苯二酚3、間苯二酚2、對苯二酚1三種異構體的分離(見圖3曲線A)。并在同樣條件下與空管柱進行了對比(見圖3曲線B)，修飾了Au-Fe₃O₄納米的電色譜柱顯示良好的分離能力。

如圖4所示，最后以通過本技術方案制得Au-Fe₃O₄磁性金納米顆粒修飾的毛細管色譜柱為電色譜柱，采用毛細管電色譜柱分離模式，以10mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.6)為流動相，分離電壓為-10kV的條件下，實現了雞蛋白中多種蛋白質，包括卵黏蛋白1、溶解酵素2、抗生物素蛋白3、卵轉鐵蛋白4、卵清蛋白5的同時分離。

通過上述內容可說明，采用本發明提供的技術方案，所制得的Au-Fe₃O₄納米修飾毛細管電色譜柱，可以成功的用于毛細管電色譜，具有特殊的分離性能。采用磁場固定的方法，將Au納米以Fe₃O₄為媒介通過Au-Fe₃O₄的形式固定到毛細管內壁，避免了化學鍵合方法的繁瑣和動態涂敷的柱壽命短等不 足。本發明方法簡便、穩定、壽命長，有潛力應用于更復雜樣品的分析分離。

【實施例2】

Au-Fe₃O₄納米修飾毛細管電色譜柱的制備方法，具體步驟包括如下：

(1)毛細管的預處理。用甲醇沖洗毛細管10min，接著用NaOH溶液沖洗毛細管1h，再用去離子水沖洗10min。

(2)按照上述本發明提供的磁性金納米顆粒分散液制備方法制得2mg/ml Janus結構的Au-Fe₃O₄納米/正己烷溶液。

(3)Au-Fe₃O₄納米修飾毛細管柱的制備。將處理好的毛細管用一定40cm的永磁鐵固定，提供一個外加磁場，用微流注射泵將帶磁性的2mg/ml Au-Fe₃O₄環已烷溶液以15ul/min的流速充入毛細管內，并保持5min。最終用10mM磷酸鈉緩沖溶液沖洗毛細管10min，即得到Au-Fe₃O₄納米修飾的毛細管色譜柱。

【實施例3】

Au-Fe₃O₄納米修飾毛細管電色譜柱的制備方法，具體步驟包括如下：

(1)毛細管的預處理。用甲醇沖洗毛細管10min，接著用NaOH溶液沖洗毛細管1h，再用去離子水沖洗10min。

(2)按照上述本發明提供的磁性金納米顆粒分散液制備方法制得5mg/ml Au-Fe₃O₄納米/正己烷溶液。

(3)Au-Fe₃O₄納米修飾毛細管柱的制備。將處理好的毛細管用一定40cm的永磁鐵固定，提供一個外加磁場，將帶磁性的2mg/ml Au-Fe₃O₄環已烷溶液用微流注射泵以20ul/min的流速充入毛細管內，并保持10min；最終用10mM磷酸鈉緩沖溶液沖洗毛細管10min，即得到Au-Fe₃O₄納米修飾的毛細管色譜柱。

將實施例2、3制得的毛細管柱按照實施例1的方法同樣進行檢測，制得的Au-Fe₃O₄納米修飾毛細管柱都可以成功的用于毛細管電色譜，分離性能較好。

綜上，由于本發明采用磁性固定的方法，將磁性金納米顆粒，尤其是Au-Fe_xO_y納米顆粒在外加磁場輔助下固定到毛細管內壁，避免了化學鍵合方法的繁瑣和動態涂敷的方法，改善毛細管色譜柱壽命短等不足，該方法所使用的原料易得，操作簡便、穩定，制得的毛細管色譜柱的使用壽命較長。

對所公開的實施例的上述說明，使本領域專業技術人員能夠實現或使用本發明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現。因此，本發明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。