一種生物表面活性劑強化植物—微生物共生體系的方法及其在原位修復鈾污染土壤中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于鈾污染土壤修復領域，特別涉及一種生物表面活性劑強化植物一微生物共生體系的方法及其在原位修復鈾污染土壤中的應用。
【背景技術】
[0002]土壤是生態環境的重要組成部分，是一個人類賴以生存的介于生物界和非生物界之間的復雜、開放的物質系統，也是一個能夠支持植物、動物和微生物生長與繁殖的生物地球化學循環的儲存庫。隨著我國核工業和核能的快速發展，鈾的使用量每年仍在不斷增加，由此產生的鈾礦廢石也很多。據不完全統計，一個年產量為10萬噸的鈾礦山，產生的鈾礦廢石的量將達到40?50萬噸，其中鈾的含量約為I X 10—4?3 X 10—4 g/g，是正常土壤的天然本底值的4?10倍。同時，鈾礦廢石中的鈾、釷、鐳等放射性核素在各種水文地球化學的作用下，會轉化為可以迀移的各種形態和價態，通過地表徑流、地下滲流和淋洗，污染周邊的土壤，并通過生物富集作用在人體內的積累，危害人們健康，給人類生存環境造成一定的威脅。因此，鈾污染土壤的修復，是保障土壤質量的首要任務，也對實現經濟社會可持續發展和保護人類健康的必要舉措。
[0003]鈾污染土壤修復主要有客土法、填埋法、覆蓋新土法、電動修復法、堆浸去污法、鈍化法和化學淋洗法等，但是這些傳統的物理、化學方法處理成本較高，容易對環境造成破壞性二次污染，而且工藝流程冗長，后續處理繁瑣，所生成的廢物還需二次處理。植物修復法是一種利用超積累植物將鈾污染土壤中的鈾以離子或者化合物的形式，轉移到植物體內的原位修復方法，具有操作簡單、費用低廉、不造成二次污染且資源化利用等優點，逐漸引起了人們的廣泛關注，具有廣闊的應用前景。
[0004]然而，植物修復也有一定的局限性，如修復植物對鈾的耐性有限，植物生長周期較長，外界環境因素對修復植物影響較大，一些固定態和沉淀態的鈾修復植物不易吸收等。很多學者通過外加化學物質強化植物修復，效果雖然明顯，但存在修復成本增加，環境風險大，外加的化學物質容易造成二次污染。
[0005]利用植物與微生物之間互利關系，探索一條既能大幅度提高植物修復鈾污染土壤的效率、又能改善土壤生態環境，資源節約、環境友好且成本低廉的生物表面活性劑強化植物一微生物共生體系新方法，并能夠真正實現綠色、高效、環保原位修復鈾污染土壤，將具有重要的理論價值和現實意義。
【發明內容】
[0006]為了克服上述現有技術的不足，本發明目的在于提供一種生物表面活性劑強化植物一微生物共生體系的方法。具體以無鈾污染土壤、蛭石、泥炭土為培養基質，以蓖麻為土壤宿主植物，以叢枝菌根為接種微生物，首先利用育苗裝置培養蓖麻幼苗，在填充有培養基質的泡沫漂浮孔穴育苗盆中對蓖麻種子進行叢枝菌根真菌接種，形成蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系，再使用自制的生物表面活性劑菌株液體代替傳統方法使用的化學表面活性劑，對蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系進行強化，得到一種生物表面活性劑強化功能的蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系，并將其應用于原位修復鈾污染土壤中。具體步驟如下:
(1)培養基質的制備
將無鈾污染土壤、蛭石和泥炭土按照一定質量比進行混合，并進行滅菌處理，即可得到所需的培養基質；
(2)生物表面活性劑菌株液體的制備
取10 g處理后的堆肥樣品，置于裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中振蕩25 min后，靜止30 min，得到土壤懸液。吸取2 mL土壤懸浮液接種到富集培養基中，放入溫度為25 °C、轉速為220 r/min的恒溫培養箱中進行振蕩培養5 d。吸取上述I mL富集培養液接種于發酵培養基中，放入溫度為30 °C、轉速為220 r/min的恒溫培養箱中進行振蕩培養，直至觀測到乳化現象。取I mL稀釋至10—3之后，以該稀釋發酵液I mL涂布于平板培養基上，于37 °C恒溫靜置培養3 d。挑選平板長勢良好的菌落進行劃線分離，按照上述方法進行再次發酵培養、馴化2次，即可得到馴化后的菌株。將馴化后的菌株在富集培養液中繼續培養I d后，吸取I mL菌液按4.5%的接種量接種于發酵培養基中，調節pH值為6.5，在溫度為25 °C、轉速為200 r/min的恒溫培養箱中，繼續進行振蕩培養2 d后，即為生物表面活性劑菌株液體。
[0007](3)蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立
將培養基質裝入20 cm X 15 cm規格的泡沫漂浮孔穴育苗盆中，每盆I kg，按照基質質量的15 %澆水，待水分滲透均勻后，在基質表層均勻噴灑一定質量的叢枝菌根菌劑。使用10 % H2O2對蓖麻種子浸泡25 min，將其陰干后均勻撒種在培養基中，每盆4顆。然后，使用保鮮膜對泡沫漂浮孔穴育苗盆進行覆蓋，以此保濕、增溫，促進蓖麻孢子萌芽、發育，為保障供應蓖麻孢子萌芽、發育及其后期幼苗生長所需的空氣，同時方便后期管理，在撒播蓖麻種子上方處的保鮮膜上扎孔4個。待蓖麻萌芽至單株含有80?100個菌根真菌孢子后，使泡沫漂浮孔穴育苗盆的下半部分浸入水中，待蓖麻種子出苗后間苗，每孔留苗I顆，并把水換成1/10強度的改良霍格蘭德營養液，3天后換成1/4強度的改良霍格蘭德營養液，2周后再更換一次1/4強度的改良霍格蘭德營養液。同時，每天對蓖麻萌芽使用含有生物表面活性劑菌株液體的水進行均勻噴淋，保持培養基質的含水量60%，在室溫下繼續培育10 d后，即可得到生物表面活性劑強化功能的蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系。
[0008](4)鈾污染土壤的原位修復
將無鈾污染土壤自然風干，過篩后，取I kg裝入50 cm X 25 cm規格的塑料花盆中，拌入河砂150 g，有機肥50 g后，然后將UO2(NO3)2.6 H2O溶液均勻噴灑在土壤中，充分攪拌混合后得到鈾污染試驗土壤。然后將上述栽培的蓖麻幼苗整株及其周圍的培養基質一起取出，移栽在鈾污染試驗土壤中。鈾污染土壤原位修復試驗在人工氣候室內完成，將塑料花盆放在長木架上，控制室內溫度，每天光照8 h，并定時澆水以保持土壤持水量在60 %。蓖麻移栽60 d后，沿土面剪取植株地上部分，同時洗出根系，在110 °(:下殺青，70 °C烘干(24 h)，分根、莖、葉稱干重，各部分植物樣品經磨碎后，用硝酸-高氯酸消解，使用ICP-AES測定各部分植物中總鈾的量。
[0009]本發明所述的步驟(I)中培養基質的制備，使用的無鈾污染土壤質量是I?2kg；蟲至石質量是1.5 ~ 4.5 kg和泥炭土的質量是0.5?0.8 kg。
[0010]本發明所述的的步驟(2)中生物表面活性劑菌株液體的制備，使用的富集培養基組成是:氯化鉀1.5 g;硫酸銨12 g;氯化鈉1.2 g;七水硫酸亞鐵3 X 10—5 g;磷酸氫二鉀
3.5g;三水磷酸氫二鉀0.65 g；EDTA 1.1 g;酵母浸膏0.6 g;植物油5 g;蒸餾水1000 mL。
[0011]本發明所述的的步驟(2)中生物表面活性劑菌株液體的制備，使用的發酵培養基組成是:氯化鉀1.5 g;硫酸銨12 g;氯化鈉1.2 g;七水硫酸亞鐵3 X 10—5 g;磷酸氫二鉀
3.5g;三水磷酸氫二鉀0.65 g;硫酸鎂0.6 g;氯化鈣0.25 g;硫酸鋅0.3 g;硫酸銅0.3 g；EDTA 1.1 g;酵母浸膏0.6 g;植物油5 g;蒸餾水1000 mL。
[0012]本發明所述的的步驟(2)中生物表面活性劑菌株液體的制備，使用的平板培養基組成是:葡萄糖20 g;蛋白胨5 g;酵母浸膏0.25 g;瓊脂20 g;蒸饋水1000 mL。
[0013]本發明所述的步驟(3)中蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立，使用的叢枝菌根菌劑為地表球囊霉、無梗囊霉和盾巨孢囊霉中的任意一種。
[0014]本發明所述的步驟(3)中蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立，使用的叢枝菌根菌劑的質量是50?60 go
[0015]本發明所述的步驟(3)中蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立，使用的改良霍格蘭德營養液組成是:四水硝酸鈣945 mg/L;硝酸鉀506 mg/L;硝酸銨80 mg/L;磷酸二氫鉀136 mg/L;硫酸鎂493 mg/L;鐵鹽溶液2.5 mL;微量元素液5 mL;蒸饋水500 mL;pH=6.0。本發明所述的步驟(3)中蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立，使用的鐵鹽溶液組成是:七水硫酸亞鐵2.78 g;乙二胺四乙酸二鈉3.73g;蒸餾水500 mL;pH=5.5。
[0016]本發明所述的步驟(3)中蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立，使用的微量元素液組成是:碘化鉀0.83 mg/L;硼酸6.2 mg/L;硫酸錳22.3 mg/L;硫酸鋅8.6 mg/L;鉬酸鈉
0.25 mg/L;硫酸銅0.025 mg/L;氯化鈷0.02 5mg/L;蒸餾水500 mL。
[0017]本發明所述的步驟(3)中蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立，使用的含有生物表面活性劑菌株液體的體積百分比是0.2?0.4 %。
[0018]本發明所述的步驟(4)中鈾污染土壤的原位修復，鈾污染土壤中含鈾的量為25?75 mg U / kg 土。
[0019]本發明所述的步驟(4)中鈾污染土壤的原位修復，控制室內溫度，具體措施是:白天溫度20?30 °C，夜間溫度16 - 20 °C。
[0020]本發明所述的一種生物表面活性劑強化植物一微生物共生體系的方法及其在原位修復鈾污染土壤中的應用，相比現有的技術，具有以下顯著優點:
(I)本發明采用生物表面活性劑強化功能的蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系來原位修復鈾污染土壤，系綠色原位修復，不會造成二次污染，同時修復過程不會破壞原有的生態環境，并有助于改善因鈾污染而引起的土壤退化和生產力下降等趨勢，恢復并提高鈾污染土壤的生物多樣性等多重優點。具有易于管理、成本低、修復效率高、環境友好、具有潛在經濟效益等多重優勢。
[0021](2)本發明在對植物-微生物共生體系進行強化過程中，將自制的一種生物表面活性劑代替傳統的化學表面活性劑，從而減少了對環境的二次污染。
[0022](3)本發明所使用的主要物質來源是廉價的自然資源物質，來源廣泛，不限產地，不需要特許功能性加工。
[0023](4)本發明所選擇的宿主植物生長周期短，生物量較大，且不易進入食物鏈傳遞而增加環境風險，從而避免了繁瑣的后續處理過程。
[0024](5)本發明在試驗的基礎上，采用漂浮育苗法，并使用生物表面活性劑強化措施建立了一種生物表面活性劑強化功能的蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系，并對污染濃度為25?75 mg U / kg 土的鈾污染土壤具有較強的修復能力。
【具體實施方式】
[0025]下面通過對實施例對本發明進行具體描述，它們只是用于對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，本領域的技術人員根據上述發明的內容做出一些非本質的改進或調整，均屬于本發明保護范圍。
[0026]實施例1:
(1)培養基質的制備
將I kg自然風干，過篩后的無鈾污染土壤，與3 kg輕石和0.8 kg泥炭土進行充分攪拌，均勻混合，并在120 °C高壓蒸汽中進行滅菌處理2 h，