一種鎘污染底泥的微生物修復方法與流程

本發明屬于底泥微生物修復領域，具體涉及一種鎘污染底泥的微生物修復方法。

背景技術：

重金屬因具有難降解性、生物累積性和食物鏈放大等生態環境效應而備受關注。水體底泥是各種污染物進入水環境后的最終歸宿，99％以上的重金屬進入水環境后會以各種形式積聚在底泥中，使底泥重金屬含量往往高出上覆水幾個數量級，從而造成底泥污染。世界范圍內，水體底泥普遍存在重金屬污染，尤其是毒性較大的鎘(cd)，例如，希臘attica工業最發達的keratsini港表層底泥中的cd高達190～1763mg/kg；倫敦東港和伊麗莎白港底泥中cd分別高達120～1630mg/kg和100～1400mg/kg；含量如此之高的cd，已遠遠超過其可能效應濃度(probableeffectconcentration，pec)，勢必對水生生物和人體健康產生毒害風險。已有研究表明，我國經濟較發達的東南沿海地區，cd生態風險最大。作為城市水環境的重要組成，底泥修復是整個水生生態系統修復的關鍵，針對鎘污染底泥，研究出切實可行的修復技術是現在的當務之急。

底泥修復方法有很多，按底泥與上覆水是否分離可分為原位修復(如覆蓋、穩定和植物修復等)和異位修復(如疏浚、清洗和電化學等)；按方法原理則又可分為物理、化學和生物修復等。對重金屬而言，盡管不能像有機污染物那樣可被生化降解，但其能在不溶和可溶物質間轉換，形態和毒性也隨之發生變化。基于此，許多修復方法試圖從降低金屬溶解性(固化)或增加金屬溶解性(活化)兩個思路對污染底泥開展修復。

固化(也稱鈍化或穩定化)通常利用穩定劑、微生物菌種、微生物制劑或生物刺激，通過理化作用(如吸附、氧化還原等)或生物作用(如生物吸附、生物積累、生物轉化等)將重金屬轉化為無毒或低毒形態的修復方法，其最終目的是降低金屬的遷移性、毒性和生物有效性；而活化方法則恰恰相反，它先是借助理化浸提或生物淋溶等使重金屬從底泥中解吸、溶解和分離，然后再對淋洗液進行后續處理，從源頭上對底泥重金屬進行減量。重金屬活化(如酸淋洗、生物浸礦等)雖能徹底將重金屬從底泥中去除，但通常是異位修復，存在工程量大、費用高昂和環境擾動大等問題；相對而言，固化技術雖然不能將污染物從底泥中徹底根除，但其操作簡便可實現底泥的原位修復，大大減少了修復的工程量以及高昂的費用，同時具有修復時間短、環境擾動小和污染釋放少等優點，是一類經濟有效的修復方法。

常見的底泥重金屬固化方法包括理化、植物和微生物固化。其中，理化固定需要投加大量的穩定劑修復材料(如水泥、粉煤灰、膨潤土、赤泥、生物炭等)，所以其修復成本與生物固化相比往往較高，該方法用于對疏浚底泥異位修復時存在底泥最終處置問題，用于原位修復時所投穩定劑還可能對水生生態系統產生一定的環境風險；植物固定主要利用植物提取、根際微生物及其生長代謝產物對重金屬進行提取或固定，但植物固定目前仍存在生長周期長和生物量小等不足，此外諸多研究表明植物自身直接提取重金屬的效果其實并不高(尤其是水生植物)，而間接作用(如根際圈微生物、氧化還原反應形成、根際圈可溶性金屬化合物沉淀)則起到更重要的作用；而微生物固化在修復成本和環境兼容性等方面則具有一定優勢，據報道，微生物固化(如生物刺激)所需費用約為理化固定的二分之一。因此，越來越多的學者關注微生物對底泥重金屬的固定。

針對重金屬微生物固化，硫酸鹽還原菌(srb)因能在硫酸鹽異化還原過程中和金屬離子形成性質穩定的金屬硫化物，可實現重金屬離子的沉淀、回收和再利用，而受到人們的廣泛關注。srb生物固化對修復重金屬污染環境介質是非常有效的，一般多用于廢水處理，尤其是礦山酸性廢水的處理。srb在廢水治理的成功應用，為srb修復重金屬污染底泥提供了很好的借鑒。但從目前研究現狀看，srb應用于底泥重金屬修復的研究并不多見，其用于重金屬修復時還存在對個別金屬穩定效率低和復合污染修復效果欠佳的不足；前人已開展的零星研究多集中于水和土壤，而對重金屬污染底泥的修復研究尚不多見，且應用較少，其中很重要的一個原因就是srb生長代謝所需的環境條件(如ph、orp、硫酸鹽、溫度、穩定電子供體等)在自然狀況下很難兼備，導致srb室內修復效果顯著，但野外測試效果欠佳。因此，亟待遴選一種環境適應能力強、修復效率高、經濟廉價的cd污染底泥的srb修復方法。

技術實現要素：

本發明提供一種cd污染底泥的微生物修復方法。該方法通過將分離鑒定后的硫酸鹽還原菌復合菌添加至cd污染底泥中，能降低cd的可交換態和碳酸鹽結合態含量，提高鐵錳氧化物、有機物結合態和殘渣態含量，使cd向穩定態轉變，并使修復后底泥間隙水中cd含量明顯下降，從而降低cd的遷移性、生物有效性和毒性，具有技術簡便、成本低、修復效果好和原位應用潛力等特點。

本發明提出的一種cd污染底泥的微生物修復方法，主要包括以下兩個步驟：

步驟一：硫酸鹽還原菌的富集、馴化與擴大培養；

(1)培養基：kh2po40.5g/l，nh4cl1g/l，caso41g/l，mgso4·7h2o2g/l，乳酸3.5g/l，酵母膏1g/l，抗壞血酸0.1g/l，巰基醋酸0.1g/l，feso4·7h2o0.5g/l，超純水1l，調節ph在7.0～7.5之間。

(2)菌種富集：挑取2g水庫天然底泥樣品，放入50ml具塞玻璃管中，加入9ml的0.75％的生理鹽水，得到10^-1的稀釋液。搖勻后，吸取2ml的底泥稀釋液加入到滅菌后的含有300ml培養基的錐形瓶中。用封口膜密封錐形瓶，將其放入30℃恒溫培養箱中培養。2～3天后，會發現錐形瓶中的液體顏色變為黑色，搖晃后會發現黑色沉淀，表明培養基中有srb存在。即已成功富集到srb。

(3)菌種馴化：吸取15ml富集得到的srb菌液加入到另一個300ml的培養基中，進行下一次純化培養，如此重復操作三次，使得到的srb更加純正。

(4)菌種擴大培養：按上述培養基配方稱取藥品后，使用超純水定容到1l，輕搖，待藥品充分溶解后，轉移到300ml錐形瓶中，用鋁箔紙封口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌后備用，滅菌條件為121℃，20min。其中，巰基醋酸和抗壞血酸需要單獨配制成10％的溶液，也需進行高壓蒸汽滅菌。根據實驗用量，對菌種進行適量擴大培養。

步驟二：硫酸鹽還原菌修復cd污染底泥。

在室溫條件下(20～30℃)，先將濕重為800g的底泥(含水率約50％)裝入2000ml燒杯中；加入超純水定容至1800ml；然后加入步驟一中擴大培養的菌液300ml；勻速攪拌使培養基與底泥充分混合；燒杯經保鮮膜密封后，放置在30℃的生化培養箱中，進行為期166天的修復。

srb對cd污染底泥的修復效果，主要根據底泥間隙水cd含量和底泥中cd化學形態變化可進行考量。cd化學形態分析采用改進tessier連續提取法。

本發明具體有的優點在于：

(1)本發明提供一種cd污染底泥的微生物修復方法，可使cd向穩定態轉變，降低底泥間隙水中cd含量，降低cd的遷移性、生物有效性和毒性；

(2)本發明提供一種cd污染底泥的微生物修復方法，具有技術簡便、成本低和修復效果好等顯著優點，且工程量小、環境擾動小和能降低二次污染，對重金屬污染底泥的原位修復有廣闊的應用潛力。

附圖說明

圖1：本發明中所用srb復合菌液在(a)門、(b)目、(c)科和(d)屬水平上的菌群組成。

圖2：本發明中用于cd底泥修復的srb擴大培養菌液，control是未加cd的原始底泥；a、b、c、d、e、f和g實驗組中cd加標量分別為0、25、50、100、200、400和600mg/kg)。

圖3：本發明中cd污染底泥經srb修復前后間隙水中cd含量。

圖4：本發明中修復過程中底泥中cd地球化學形態含量變化；a、b、c、d、e、f和g實驗組中cd加標量分別為0、25、50、100、200、400和600mg/kg；f1、f2、f3、f4和f5分別代表cd的可交換態、碳酸鹽結合態、鐵錳氧化物結合態、有機物結合態和殘渣態。

圖5：本發明中經srb修復后底泥(實驗組g，含cd600mg/kg)x射線光電子能譜分析；(a)和(b)分別為對照組166天后cd和s的xps分析結果；(c)和(d)分別為修復組166天后cd和s的xps分析結果。

具體實施方式

下面將結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細說明。

本發明提供cd污染底泥的微生物修復方法，具體包括以下兩個步驟：

步驟一：硫酸鹽還原菌的富集、馴化與擴大培養。

(1)培養基：kh2po40.5g/l，nh4cl1g/l，caso41g/l，mgso4·7h2o2g/l，乳酸3.5g/l，酵母膏1g/l，抗壞血酸0.1g/l，巰基醋酸0.1g/l，feso4·7h2o0.5g/l，超純水1l，調節ph值在7.0～7.5之間。

(2)菌種富集：挑取2g水庫天然底泥樣品，放入50ml具塞玻璃管中，加入9ml的0.75％(質量百分比)的生理鹽水，得到10^-1的底泥稀釋液。搖勻后，吸取2ml的底泥稀釋液加入到滅菌后的含有300ml培養基的錐形瓶中。用封口膜密封錐形瓶，將其放入30℃恒溫培養箱中培養。2～3天后，會發現錐形瓶中的液體顏色變為黑色，搖晃后會發現黑色沉淀，表明培養基中有srb存在。即已成功富集到srb。

(3)菌種馴化：吸取15ml富集得到的srb菌液加入到另一個300ml的培養基中，進行下一次純化培養，如此重復操作三次，使得到的srb更加純正。根據16srrna鑒定結果，該srb菌群是一種復合菌，其在門、目、科和屬水平上的菌群組成見圖1所示，圖中，(a)中：bacteroidetes為擬桿菌門、firmicutes為厚壁菌門、proteobacteria為變形菌門；(b)中：bacteroidales為擬桿菌目、clostridiales為梭菌目、desulfovibrionales為脫硫弧菌目、bacillales為芽孢桿菌目、other為比例小于1％菌群之和；(c)中：porphyromonadaceae為紫單胞菌科、lachnospiraceae為毛螺菌科、clostridiaceae_1為梭菌科_1、desulfovibrionaceae為脫疏弧菌科、bacillaceae為芽胞桿菌科、ruminococcaceae為疣微菌科、family_xi為梭菌目的xi科、bacteroidaceae為擬桿菌科、christensenellaceae為克里斯滕森菌科；(d)中：macellibacteroides為鐵還原菌屬、lachnoclostridium為梭菌屬、desulfovibrio為脫硫弧菌屬、clostridium_sensu_stricto_12為梭菌屬stricto_12、bacillus為芽孢桿菌屬、clostridium_sensu_stricto_1為梭菌屬stricto_1、sedimentibacter為沉淀桿屬、bacteroides為擬桿菌屬、anaerotruncus為厭氧球菌屬、ruminococcaceae_ucg-009為疣微菌科ucg-009屬)。復合菌中，脫硫弧菌是典型的srb，其在目(desulfovibrionales脫硫弧菌目)、科(desulfovibrionaceae脫疏弧菌科)和屬(desulfovibrio脫硫弧菌屬)水平上的細菌豐度為8.28％。

(4)菌種擴大培養：按上述培養基配方稱取藥品后，使用超純水定容到1l，輕搖，待藥品充分溶解后，轉移到300ml錐形瓶中，用鋁箔紙封口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌后備用，滅菌條件為121℃，20min。其中，巰基醋酸和抗壞血酸需要單獨配制成質量百分比含量為10％的溶液，也需進行高壓蒸汽滅菌。根據實驗用量，對經過菌種馴化后的srb菌種進行適量擴大培養(每300ml培養基中加入15ml馴化后的srb菌液)。菌液經擴大培養，待出現黑色后(如圖2所示)，即可用于底泥修復。

步驟二：硫酸鹽還原菌修復cd污染底泥。

在室溫條件下(20～30℃)，先將濕重為800g的底泥(含水率約50％)裝入2000ml燒杯中；加入超純水定容至1800ml；然后加入步驟一中擴大培養的菌液300ml；勻速攪拌使培養基與底泥充分混合；燒杯經保鮮膜密封后，放置在30℃的生化培養箱中，進行為期166天的修復。

srb對cd污染底泥的修復效果，主要根據底泥間隙水cd含量和底泥中cd化學形態變化進行考量。其中，間隙水cd含量的測試方法為：取已去除明顯上覆水的濕泥20g至50ml離心管；在4800r/min條件下離心30min后，用一次性注射器吸取上清液；然后過0.45μm微孔濾膜后，測定間隙水中cd含量。底泥cd化學形態分析方法為：利用改進的tessier連續提取法分析底泥cd化學形態，經連續提取后，cd共分為五種形態，即可交換態(f1)、碳酸鹽結合態(f2)、鐵錳氧化物結合態(f3)、硫化物及有機物結合態(f4，俗稱有機物結合態)和殘渣態(f5)。

改進tessier連續提取法具體操作步驟：

①可交換態：稱取1.000g底泥(干重)至50ml離心管中，加入1mol/l的mgcl2(ph＝7)溶液8ml，在25±1℃下振蕩提取1h后，離心(4500rpm，20min)，用5ml移液槍取4ml上清液；向提取液中加入1ml70％的濃硝酸，搖勻，之后將消解管放到消解爐上以140℃加熱至完全干燥為止(約需7h)，待溫度降到70℃左右時再加入2％(質量百分比濃度)的hno3后定容到8ml，待測；用16ml超純水洗滌殘余物，離心(4500rpm，20min)，棄去上清液，重復操作洗滌三次，洗滌后的殘渣經-18℃冷凍后(一般隔夜)用于下一步提取。

②碳酸鹽結合態：將步驟①提取后的冷凍殘渣，加入1mol/l的naoac溶液8ml(醋酸調ph＝5)，在25±1℃條件下振蕩提取5h后，離心(4500rpm，20min)，用5ml移液槍取1ml上清液；向提取液中加入1ml70％(質量百分比濃度)的濃硝酸，搖勻，之后將消解管放到自制消解爐上以140℃加熱至完全干燥為止(約需2h)，待溫度降到70℃左右時再加入2％(質量百分比濃度)的hno3后定容到8ml，待測；用16ml超純水洗滌殘余物，離心(4500rpm，20min)，棄去上清液，重復操作洗滌三次，洗滌后的殘渣經-18℃冷凍后用于下一步提取。

③鐵錳氧化物結合態：在步驟②提取后的冷凍殘渣中，加入20ml0.04mol/l的nh2oh·hcl的25％(質量百分比濃度)hac溶液，在96±3℃條件下振蕩提取6h(注意及時補充水)，冷卻離心(4500rpm，20min)，用5ml移液槍取15ml上清液；向提取液中加入1ml70％(質量百分比濃度)的濃硝酸，搖勻，之后將消解管放到自制消解爐上以140℃加熱至完全干燥為止(約需2.5h)，待溫度降到70℃左右時再加入2％(質量百分比濃度)的hno3后定容到8ml，待測；用16ml超純水洗滌殘余物，離心(4500rpm，20min)，棄去上清液，重復操作洗滌三次，洗滌后的殘渣經-18℃冷凍后用于下一步提取。

④有機物結合態：在步驟③提取后的冷凍殘渣中，加入3ml0.02mol/l的hno3的溶液，再加入5ml30％的h2o2(用稀硝酸調ph＝2)，85±2℃條件下振蕩提取2h(注意及時補充水)后，加入3ml30％(質量百分比濃度)的h2o2(ph＝2)，在85±2℃條件下再振蕩提取3h，冷卻至25±1℃，加入5ml3.2mol/l的nh4oac的20％(質量百分比濃度)hno3溶液，并用超純水稀釋到20ml后再振蕩提取30min，再次離心(4500rpm，20min)，取15ml上清液；向提取液中加入1ml70％(質量百分比濃度)的濃硝酸，搖勻，之后將消解管放到自制消解爐上以140℃加熱至完全干燥為止(約需5.5h)，待溫度降到70℃左右時再加入2％(質量百分比濃度)的hno3后定容到8ml，待測；用16ml超純水洗滌殘余物，離心(4500rpm，20min)，棄去上清液，重復操作洗滌三次，洗滌后的殘渣經-18℃冷凍后用于下一步提取。

⑤殘渣態：將步驟④提取后的冷凍殘渣轉移至消解管中，依次加入65％～68％(質量百分比濃度)的hno31ml和70％～72％(質量百分比濃度)hclo44ml，加完之后按照以下的加熱程序方式進行：50℃加熱3h，70℃加熱0.5h，100℃加熱0.5h，150℃加熱3h，190℃加熱至完全干燥(約需11h)；待溫度降到70℃左右時再加入2％(質量百分比濃度)的hno3后定容到8ml，離心(4500rpm，20min)，取上清液待測。①～⑤待測樣種重金屬fe和mn由icp-oes測定，cd等由icp-ms測定。

實施例1：

本實施例中提供cd污染底泥的微生物修復方法，具體包括以下兩個步驟：

步驟一：硫酸鹽還原菌的富集、馴化與擴大培養

(1)培養基：kh2po40.5g/l，nh4cl1g/l，caso41g/l，mgso4·7h2o2g/l，乳酸3.5g/l，酵母膏1g/l，抗壞血酸0.1g/l，巰基醋酸0.1g/l，feso4·7h2o0.5g/l，超純水1l，調節ph在7.0～7.5之間。

(2)菌種富集：挑取2g水庫天然底泥樣品，放入50ml具塞玻璃管中，加入9ml的0.75％(質量百分比濃度)的生理鹽水，得到10^-1的稀釋液。搖勻后，吸取2ml的底泥稀釋液加入到滅菌后的含有300ml培養基的錐形瓶中。用封口膜密封錐形瓶，將其放入30℃恒溫培養箱中培養。2～3天后，會發現錐形瓶中的液體顏色變為黑色，搖晃后會發現黑色沉淀，表明培養基中有srb存在。即已成功富集到srb菌液。

(3)菌種馴化：吸取15ml富集得到的srb菌液加入到另一個300ml的培養基中，進行下一次純化培養，如此重復操作三次，使得到的srb更加純正。根據16srrna鑒定結果，該srb菌群是一種復合菌，其在門、目、科和屬水平上的菌群組成見圖1所示。復合菌中，脫硫弧菌是典型的srb，其在目(desulfovibrionales脫硫弧菌目)、科(desulfovibrionaceae脫疏弧菌科)和屬(desulfovibrio脫硫弧菌屬)水平上的細菌豐度為8.28％。

(4)菌種擴大培養：按上述培養基配方稱取藥品后，使用超純水定容到1l，輕搖，待藥品充分溶解后，轉移到300ml錐形瓶中，用鋁箔紙封口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌后備用，滅菌條件為121℃，20min。其中，巰基醋酸和抗壞血酸需要單獨配制成10％(質量百分比濃度)的水溶液，也需進行高壓蒸汽滅菌。根據實驗用量，對菌種進行適量擴大培養。經擴大培養后，用于底泥修復的菌液如圖2所示。

步驟二：硫酸鹽還原菌修復cd污染底泥。

(1)在室溫條件下(20～30℃)，分別取濕重為800g的底泥(含水率約50％)放置在標號為a、b、c、d、e、f和g七個2000ml燒杯中，加超純水定容至1800ml。然后分別加入cd含量為0.01gm/l的儲備液(由cd(no3)2·4h2o配制)0、1、2、4、6、8、16和24ml。假設cd能全部被底泥所吸附，則各實驗組底泥中cd設計濃度應分別為0、25、50、100、200、400和600mg/kg。各加標實驗組有4個平行樣。

(2)向各加標實驗組加入步驟一中擴大培養的菌液300ml；勻速攪拌使培養基與底泥充分混合；燒杯經保鮮膜密封后，放置在30℃的生化培養箱中，進行為期166天的修復。空白對照組中僅加入300ml滅菌后的超純水。

(3)修復組分別在修復前、修復后第5、32、61、103和166天采集底泥樣品，進行重金屬形態分析；空白對照組僅在修復實驗開始前和修復后166天共進行兩次底泥采樣；測定了原底泥樣品、166d后的各修復組和空白對照組中底泥間隙水中cd含量：取20g泥(無明顯上覆水)至50ml離心管，4800r/min離心30min，用一次性注射器吸取上清液，過0.45um微孔濾膜后，冷藏待測。

(4)底泥樣品經自然風干后，按改進tessier連續提取法進行處理；待測液體樣品中，fe和mn由icp-oes(optima5300dv)測定；cd等由icp-ms(vgpq2turbo)測定。

(5)修復效果主要根據底泥間隙水cd含量和底泥中cd化學形態變化進行考量。

①間隙水中的重金屬含量取決于底泥中重金屬的總量及其(溶解)遷移性，因此間隙水重金屬含量可以反映的底泥中金屬的遷移性，并在很大程度上可以真實反映底泥的污染狀況以及生物的實際暴露情況。在本實驗研究中，加菌修復后，各實驗組間隙水的cd含量都明顯低于未修復組(圖3)，其中高濃度實驗組(e～g)效果更顯著，修復組比未修復組低11～27倍，說明加菌修復顯著降低了cd的(溶解)遷移性。

②金屬各形態的相對百分含量能直觀表現其地球化學形態分布。修復過程中，各實驗組cd形態質量百分含量變化如圖4所示。f1由修復前的16.3％～37.3％(均值27.2％)降至修復后7.0％～24.1％(均值14.7％)；f2由28.1％～40.8％(均值34.5％)降至22.7％～36.1％(均值31.6％)；相反，f3由28.5％～53.0％(均值36.7％)增加至41.1％～66.5％(均值51.5％)；f4由1.1％～2.5％(均值1.6％)增加至1.9％～2.5％(均值2.1％)；f5由0.0％～0.11％(均值0.03％)增加至0.0％～0.12％(均值0.06％)。以上數據說明，經srb修復后，底泥cd非穩定態(尤其是可交換態)含量明顯減少，而相對穩定態(尤其是鐵錳氧化物結合態和有機物結合態)含量增加了。

為鑒定srb修復過程中是否有cds生成，以實驗組g為例(含cd600mg/kg)，利用x射線光電子能譜(xps)分析了其空白對照組和加菌修復組底泥中cd和s的價態(圖5)。分析結果表明，空白對照組和加菌修復組都有cds生成。具體來說，空白對照組的cd3d光譜峰位出現在405ev(cd3d5/2)，411.5ev(cd3d3/2)，405.6ev(cd3d5/2)和412.3ev(cd3d3/2)；s2p光譜峰位出現在163.7ev(s2p3/2)，164.9ev(s2p1/2)和168ev(s2p)；加菌修復組的cd3d光譜峰位出現在405.3ev(cd3d5/2)，412ev(cd3d3/2)，405.7ev(cd3d5/2)和412.5ev(cd3d3/2)；s2p光譜峰位出現在169.4ev(s2p)，161.6ev(s2p3/2)和162.8ev(s2p1/2)。但是xps分析結果同時還表明，加菌修復組中的cds(28.9％)大于空白對照組(27.3％)，說明加菌修復確實能促進金屬硫化物形成，更能使cd化學形態向穩定態轉變。