一種開放海域沉積物污染的修復方法與流程

本發明涉及利用微生物進行水環境治理領域，具體地說，本發明涉及一種開放海域或較深淡水水域、河口等沉積物污染的修復方法。

背景技術：

海洋有機污染，特別是海洋石油溢油及石油污染問題一直是影響海洋環境和海洋生態的重要問題，目前對于海洋石油污染，特別是突發性溢油事故的應急處理，主要針對溢油發生初期的海洋表層海水，采用物理攔截、回收、化學分散劑等方式進行應急處置。但是對于海底溢油或者隨水體運動沉降至海底沉積物中的石油污染，目前還沒有很好的物理、化學處理方法，沉積物中石油降解微生物的環境自凈和人為導入石油降解微生物是目前解決海洋沉積物石油污染的主要方式。

目前對于河流沉積物有機污染的治理已經有比較成功的工程實施案例，主要是利用物理、化學、生物的方式，采用沉積物翻耕及相關修復試劑的投放的方式。但是目前海洋沉積物石油污染微生物修復大多處在理論研究和小規模實驗室模擬海洋環境實驗層面，大規模的近海沉積物石油污染微生物修復的示范和工程還很少。這一方面是由于海洋環境特殊，海上施工對于天氣、海況、施工船只及海上操作經驗要求嚴格，現在大部分針對海洋的有機污染特別是石油污染修復，工程示范主要集中于灘涂區域，缺少開放海域沉積物污染的微生物修復方法及應用。

技術實現要素：

本發明目的在于提供一種開放海域或較深淡水水域、河口等沉積物污染的修復方法。

為實現上述目的，本發明采用技術方案為：

一種開放海域沉積物污染的修復方法，將菌株經沸石負載并絮凝劑包覆，而后將包覆后菌劑投放至待處理水域，進而修復水域內沉積物石油及有機污染物；

所述菌株為醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌中的一種或幾種的混合；其中，醋酸鈣不動桿菌已于2010年6月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：CGMCCNo.3887；惡臭假單胞菌已于2010年11月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：CGMCC No.4311；沙福芽孢桿菌已于2016年9月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：CGMCC No.13059。

所述修復開放海域中石油污染沉積物時采用的菌株為醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌中的一種或幾種。

所述沉積物修復主要針對有機污染嚴重的開放海域或較深淡水水域、河口，即近海及河口沉積物，包括石油污染、抗生素污染、雌激素污染等。

所述修復開放海域中抗生素污染沉積物時采用的菌株為醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌總菌量控制在1×10⁹CFU/ml-5×10⁹CFU/ml之間，并且3株菌株按菌株個數2∶2∶1的比例混合；

所述修復開放海域中石油污染沉積物時采用的菌株為醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌總菌量控制在1×10⁹CFU/ml-5×10⁹CFU/ml之間，并且3株菌株按菌株個數3∶2∶4的比例混合；

所述菌株菌液與以沸石進行混合，而后再加入聚谷氨酸進行包覆，經包覆后加入至天然纖維材質包裝，待用。

所述菌液與沸石按1∶1-2∶1質量比混合；

所述7％聚谷氨酸與上述菌液的質量比為1∶10。所述天然纖維材質為麻袋，每包產品量為5-10kg。

所述沸石為粒徑在1-5毫米。

具體步驟如下：

(1)土著降解微生物：污染修復微生物的選擇應避免外來物種的引入，以修復海域沉積物中的土著菌種作為菌種來源，以待修復的污染物(石油或其他有機物)作為唯一碳源，通過富集培養和分離培養，篩選能夠高效降解待修復污染物的微生物菌株；

其中，菌株為醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌中的一種或幾種的混合；其中，醋酸鈣不動桿菌已于2010年6月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：CGMCC No.3887；惡臭假單胞菌已于2010年11月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：CGMCC No.4311；沙福芽孢桿菌已于2016年9月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：CGMCC No.13059。

上述中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

(2)微生物菌株的組合：充分發揮生物之間的協同作用，通過正交實驗標準比例進行不同菌株濃度分配，得到最佳降解效果的菌株組合比例；

其中，醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌總菌量控制在1×10⁹CFU/ml-5×10⁹CFU/ml之間，并且3株菌株按菌株個數2∶2∶1的比例混合；

醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌總菌量控制在1×10⁹CFU/ml-5×10⁹CFU/ml之間，并且3株菌株按菌株個數3∶2∶4的比例混合。

(3)沸石負載及包覆：以1-5毫米粒徑的沸石作為吸附材料，對單一或組合菌株進行吸附，為減少菌株投放過程中的損失、減緩菌株在海洋沉積物中的釋放速度，需對吸附菌株的沸石進行絮凝劑(絮凝劑為聚谷氨酸)的包裹；

上述采用沸石其粒徑越小吸附效率越高，但沉降速度越慢，投放逸散越大；沸石吸附菌液后控水濾液，沸石含水率在50-70％時，采用7％的聚谷氨酸包裹。

(4)菌劑投放包裝：采用小包裝的天然纖維材質包裝(如麻袋)，包裝大小需要根據水深進行判斷(1-5千克)；

(5)菌劑投放：投放過程采用傳送帶拋投的方式，根據海域面積及石油污染情況進行傳送帶間距設置及拋投速度的確定；

(6)跟蹤監測：投放后，需對修復效果進行跟蹤監測，根據修復海域水溫及污染情況進行跟蹤監測時間的確定(1個月、2個月、3個月)。

上述最終投放微生物菌株需要通過安全評估，保證大規模投放不會對海域造成生物污染和二次污染。

獲得的菌劑包裝必須為純天然可降解材質，保證不會向修復海域引入難降解污染物，材質的快速降解能夠保證污染物降解菌的釋放效果。

獲得菌劑投放過程中，可配合水下監視監控系統，進行拋投效果的確定；水下監視監控系統需保證充足照明，拋投過程中沉積物的擾動會影響觀測效果。

跟蹤監測主要目標為：海域沉積物及上覆水的石油烴含量、海域沉積物及上覆水的微生物細菌密度、海域沉積物中的沸石顆粒。

本發明所具有的優點：

本發明方法通過篩選獲得土著降解的菌株，將獲得菌株進行負載、絮凝、包埋而后應用海域進行修復，采用本發明的修復方式能夠最大程度的保證修復菌株到達指定海底沉積物，且能夠保證菌株的修復效果；菌劑在投放時不需要復雜儀器設備，且能夠保證投放效果和修復效果。綜上所述，本發明方法是一種科學、合理、高效、安全，且操作較簡單、適用于水深2-50米的開放水域的沉積物污染修復，具體為：

土著降解微生物的篩選是污染修復微生物的篩選和使用，應避免外來物種的引入，以修復海域沉積物中的土著菌種作為菌種來源，以待修復的污染物(石油或其他有機物)作為唯一碳源，通過富集培養和分離培養，篩選能夠高效降解待修復污染物的微生物菌株；

本發明菌株篩選采集于待修復區域的沉積物樣品，從沉積物樣品中篩選土著降解菌株，進而可以有效避免外來物種的引入，避免造成大規模的生物污染，破壞海洋生態；對于單一菌株，需要進行生物急性毒性試驗，評估其安全性，對于有明顯致死效應的菌株，應該在產品中剔除。不同菌株的組合可以采用96孔板法，可有效減少菌株組合時工作量和工作時間。同時通過菌株間的協同作用獲得復合菌株，對環境中多種有機污染進行降解和修復，如石油、抗生素污染等，另外多種菌株復合投放，更有利于形成生物膜，增加菌株成活概率和污染物降解效果。

將上述獲得菌株經負載、絮凝、包埋獲得菌劑，吸附材料選擇可根據水深進行選擇，沸石適用于較深水域的沉積物修復，且沸石粒徑應在1毫米以上，確保菌劑能夠快速沉降至海底，以減少菌劑在下落過程中，在水體中的損失；采用絮凝劑的團聚和包埋，也可減少菌劑投放時的損失。絮凝劑選擇需要考慮pH及生物可降解性，由于微生物生長條件的限制，絮凝劑工作時的pH應維持在5-8之間，特殊噬酸或噬堿微生物可根據微生物的最適生長條件，確定絮凝劑；綠色可降解的絮凝劑，不僅能夠使菌劑團聚，還能為微生物提供一定碳源，保證修復微生物的生長。菌劑包裝采用純天然可降解材質，保證不會向修復海域引入難降解污染物，材質的快速降解能夠保證污染物降解菌的釋放效果。具體分包重量需要根據水深和水流情況進行確定，具體分包標準是在保證菌包的投放范圍(偏移范圍)內，盡量選擇較小的包裝，但菌包沉降至海底沉積物的偏移范圍與菌包大小和水流速度直接相關，確定菌包大小前可通過數值模擬進行判斷。

上述本發明獲得菌包投放過程應保證操作施工的安全性，小包裝菌包海面拋灑可最大程度的保證安全性，傳送帶的輸送，可減少人力支出，加快投放速度和投放均勻度。另外，在菌劑投放過程中，可配合水下監視監控系統，進行拋投效果的確定；水下監視監控系統需保證充足照明，拋投過程中沉積物的擾動會影響觀測效果。

附圖說明

圖1為本發明實施例提供的不同菌株混合比例的石油降解效率對比圖

圖2為本發明實施例提供的海域沉積物石油污染修復效果評估結果圖(其中A為石油中C₁₂-C₂₇修復效果；B為輕重烴比值下降情況；C為石油中多環芳烴修復效果)。

圖3為本發明實施例提供的單菌株與復合菌種對呋喃唑酮的降解效果對比圖。

圖4為本發明實施例提供的載體吸附前后呋喃唑酮的降解效率對比圖。

具體實施方式

實施例用于進一步說明本發明，但本發明不限于實施例。

本發明方法主要針對水深在2-50米的海水/淡水水域，對沉積物的石油污染及其他有機污染有很好的修復效果，該方法系統完整且操作方法簡單、沉積物修復效果顯著、無二次污染且海上施工安全性較高，特別適合特殊功能性海域，如石油開采區、水產養殖區等，能夠指導海洋沉積物污染修復工程的實施。

本發明采用的菌株從待修復區域的沉積物樣品中獲得土著降解菌株，其有效避免外來物種的引入，避免造成大規模的生物污染，破壞海洋生態；菌劑吸附材料(例如沸石等)選擇可根據水深進行選擇，沸石適用于較深水域的沉積物修復，且沸石粒徑應在1毫米以上，確保菌劑能夠快速沉降至海底，以減少菌劑在下落過程中，在水體中的損失；采用絮凝劑的團聚和包埋，也可減少菌劑投放時的損失。

其中，絮凝劑選擇需要考慮pH及生物可降解性，由于微生物生長條件的限制，絮凝劑工作時的pH應維持在5-8之間；綠色可降解的絮凝劑，不僅能夠使菌劑團聚，還能為微生物提供一定碳源，保證修復微生物的生長。

并在在獲得菌劑時采用純天然可降解材質進行包裝，保證不會向修復海域引入難降解污染物，材質的快速降解能夠保證污染物降解菌的釋放效果。具體分包重量需要根據水深和水流情況進行確定，具體分包標準是在保證菌包的投放范圍(偏移范圍)內，盡量選擇較小的包裝，但菌包沉降至海底沉積物的偏移范圍與菌包大小和水流速度直接相關，確定菌包大小前可通過數值模擬進行判斷。

上述獲得菌劑菌包投放過程應保證操作施工的安全性，小包裝菌包海面拋灑可最大程度的保證安全性，傳送帶的輸送，可減少人力支出，加快投放速度和投放均勻度。另外，在菌劑投放過程中，可配合水下監視監控系統，進行拋投效果的確定；水下監視監控系統需保證充足照明，拋投過程中沉積物的擾動會影響觀測效果。

修復后的跟蹤監主要針對海域沉積物及上覆水的有機污染含量、海域沉積物及上覆水的微生物細菌密度、海域沉積物中的沸石顆粒三個方面進行效果的評估。

實施例1高效石油降解菌的篩選及組合

以煙臺海域沉積物中的微生物作為高效石油降解菌來源，篩選對石油污染具有很好降解效果的土著菌株，并按最大降解效果比例進行菌液混合，吸附于沸石表面，并用被膜劑包裹，最終進行分包投放，完成渤海指定海域沉積物石油污染的生物修復。

(1)菌株篩選：稱取2g石油污染的海水沉積物樣品分別加入盛有海水培養基和淡水培養基的三角瓶中，30℃，180r/min的恒溫搖床上進行振蕩培養3d后，移取1mL培養液接入篩選培養基中，30℃，180r/min的恒溫搖床上進行振蕩培養5d后，移取1mL培養液接入新的篩選培養基中，同樣條件培養5d，共重復3次。經3個周期培養后取培養液，梯度稀釋后分別涂布于海水固體培養基和淡水固體培養基上，30℃培養12-24h，挑選不同形態單一菌落進行劃線、純化培養，直至得到無雜菌的單一菌落。

(2)微生物菌株：醋酸鈣不動桿菌(T32)、惡臭假單胞菌(SP1)、沙福芽孢桿菌(Bb)。最終篩選出對石油7日降解效率高于50％的菌株三株，經鑒定分別為醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌、沙福芽孢桿菌。

(3)最大降解效果比例：按照水平正交實驗中的比例進行菌株組合，采用96孔板方式進行不同組合比例的石油降解效果對比，選擇最佳降解比例。經試驗，醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌、沙福芽孢桿菌的最佳組合比例為3∶2∶4。(附圖1)

步驟(1)中的培養基配方為：

海水培養基：Trypton 5g，Yeast Extract 1g，Fe₂(PO4)₃ 0.01g，加入陳海水至1L，調節pH至7.0-7.2。海水固體培養基：海水培養基基礎上加入20g瓊脂。

淡水培養基：Trypton 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，加入蒸餾水至1L，調節pH至7.0-7.2。淡水固體培養基：淡水培養基基礎上加入20g瓊脂。

篩選培養基：2g原油(蓬萊溢油事故的石油)加入1L MM培養基中。

MM培養基：NH₄NO₃ 1g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO₄ 0.2g，螯合態鐵溶液1mL(FeSO₄·7H₂O 0.246g，EDTA二鈉0.331g，dH2O up to 100mL)，微量元素溶液1mL(Na₂MoO₄·2H₂O 0.01g，MnCl₂0.02g，CoCl₂·6H₂O 0.0002g，ZnSO₄·7H₂O 0.01g，CuSO₄·5H₂O 0.02g，ddH2O up to 100mL，2％wt/vol K₂CO₃調節pH至7.0-7.2)，ddH₂O up to1L，調節pH至7.0-7.2。

步驟(3)中，具體實驗方法：

A.取一定量的原油，分別溶于一定量的石油醚、正己烷和1∶1的石油醚正己烷混合液中，制成0.5％的石油萃取物溶液，離心過濾，將混合均勻的石油溶液注入96孔板中，每孔加300ul，通風處中過夜，使有機溶劑揮發，石油留在孔板側壁和底部。

B.3種菌種取出，分別活化，擴大培養(擴大培養的培養基為步驟(1)中的海水培養基)，約培養至OD＝1，8000r常溫離心1min，收集菌體，用MM培養基重懸沖洗，離心沖洗三遍，以MM重懸，而后按菌落個數比為1∶1∶1、1∶2∶2、1∶3∶3、1∶4∶4、2∶1∶2、2∶2∶1、2∶3∶4、2∶4∶3、3∶1∶3、3∶2∶4、3∶3∶1、3∶4∶2、4∶1∶4、4∶2∶3、4∶3∶2、4∶4∶1不同的比例將上述重懸的菌液混合，并用MM補足300ul，空白MM作為對照，每種比例重復三次，放入培養箱中，28攝氏度培養。

C.7天后取出孔板，低溫烘干，分別以石油醚、正己烷和1∶1的石油醚正己烷混合液復溶孔板中的石油，并于225nm波長下測定各孔板的紫外吸光度，確定石油的降解效率(參見圖1)。

其中石油醚萃取物代表長鏈石油烴，正己烷萃取物代表短鏈石油烴，混合萃取物即為混合石油烴，通過對三種不同石油烴的最適合降解比例的研究，可以針對不同類型的石油污染物進行不同比例菌株的混合，以達到最佳效果，即，針對污染物為短鏈石油烴成分，菌株菌落個數比為1∶2∶2；針對污染物為長鏈石油烴成分，菌株菌落個數比為4∶3∶2；針對污染物為混合石油烴成分，菌株菌落個數比為3∶2∶4。大部分石油污染均為混合石油烴污染。

實施例2海域沉積物石油污染微生物修復

對渤海海域沉積物石油污染進行修復。

(1)修復菌株：醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌。

(2)菌株發酵及混合：三種菌株分別進行大規模發酵，發酵后菌液分別濃度為2-3OD。發酵后醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌、沙福芽孢桿菌按照菌株菌落各數比3∶2∶4進行菌液混合，混合菌液中總菌量約為1×10⁹CFU/ml，混合后于4攝氏度冷庫冷藏保存。

(3)菌液的吸附與包裹：混合后的菌液按菌液與沸石質量比2∶1進行混合吸附，吸附時間為2小時，混合后于過水篩空水，待吸附菌液的沸石含水率為60％-70％后，噴入7wt％聚谷氨酸溶液，并不斷混拌，直至沸石成團且無流動液體，制成石油修復菌劑，并置于內附防水不透氣膜的噸袋中4℃保存。所述7％聚谷氨酸與上述混合菌液的質量比為1∶10。

(4)菌劑分包及投放：根據水深(25-30米)、水流(0.1-0.6m/s)情況，進行數值模擬，確定菌包大小為5kg，以天然易降解的麻袋作為包裝材料，快速進行分包后，每20袋小包裝統一包裝在內附防水不透氣膜的噸袋內，便于運輸。分包結束，立刻進行海上投放。

(5)修復后的跟蹤監測：菌劑投放結束后一個月，進行一次修復效果監測評估，主要的監測項目有海域沉積物及上覆水的石油烴含量、海域沉積物及上覆水的微生物細菌密度、海域沉積物中的沸石顆粒等，通過修復后效果評估，大部分修復站位的石油降解效率在50％以上，石油含量較高的部分站位降解效率可高達70-80％。(參見圖2)

步驟(4)中海上投放方法采用傳送帶拋投法，根據船體寬度及菌劑投放量設置傳送帶間隔：

傳送帶：長9.6m，每隔1.6m進行標記；

傳送帶間隔：3m；

傳送帶數量：3條；

輸送機帶速：0.8m/s；

船速：3節(根據實際情況可進行調整)(約1.5m/s)；

投放速度：每2秒一袋；

船只間隔9m往返航行。

步驟(5)中修復后的跟蹤監測結果顯示：對于修復后初次采集樣品，本底石油含量較高的站位5、6，修復效果最好，正構烷烴含量分別降解了65.0％和39.6％。受微生物降解的影響，其中輕重烴比值LMW/HMW相對于修復前總體呈減小趨勢。組合菌對C15-C27前的烷烴利用較好，降解率較高，達18.05-89.50％；對高碳數鏈烷烴n-C28-n-C36的烷烴利用效果較差，降解效率低。多環芳烴與正構烷烴類似，其中本底石油含量較高的站位5和6修復效果最好，多環芳烴含量分別降解了48.54％和78.62％，其它點位降解率為25％-52％。(圖2)

實施例3海水中呋喃唑酮類抗生素污染的微生物修復

通醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌及沙福芽孢桿菌的組合菌劑，對海水中呋喃唑酮類抗生素抗生素具有很好的降解效果。

(1)微生物菌株：醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌、沙福芽孢桿菌；

(2)菌株的組合：按照三水平三因素正交試驗進行濃度比例將醋酸鈣不動桿菌、惡臭假單胞菌、沙福芽孢桿菌三種菌株濃度比例為2∶2∶1混合，最終以總菌量為1×10⁸接種于含有500ppm呋喃唑酮的無機鹽蛋白胨液體培養基中進行培養，以未接種降解菌株的含有呋喃唑酮的無機鹽蛋白胨液體培養基作為對照。在不同的時間點取出500ul的培養液，13，000rpm離心5min，收集上清液。以HPLC檢測并計算不同菌株組合的呋喃唑酮降解效率。

(3)載體吸附對降解效率的影響：以沸石作為載體，篩選降解效果最好的菌株比例，各菌株單獨培養后按比例混合，以粒徑1-2mm的沸石吸附，吸附后加入至含有不同濃度的呋喃唑酮的無機鹽蛋白胨液體培養基中進行培養，以未以載體吸附菌株的含有呋喃唑酮的無機鹽蛋白胨液體培養基作為對照。在不同的時間點取出500ul的培養液，13，000rpm離心5min，收集上清液。以HPLC檢測并計算不同菌株組合的呋喃唑酮降解效率。

步驟(2)中無機鹽蛋白胨培養基的配方為：Na₂HPO₄·12H₂O 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，NaCl 3g/L，MgSO₄ 0.3g/L，Tryptone 2.5g/L；調節pH6.0-8.0，121℃條件下滅菌30分鐘。

步驟(2)、(3)中高效液相色譜檢測條件為：液相色譜儀：skyrayLC-310液相色譜系統；色譜柱:WATERC18柱250mm×416mm,粒度5μm；檢測條件為流動相,V(乙腈):V(乙酸水溶液)[V(乙酸)：V(水)＝1：1000]＝55：45；進樣量為20μL；溫度為25℃；紫外檢測器檢測參數為檢測波長365nm。

結果證明，菌株的組合優化和沸石載體吸附可大幅度提高呋喃唑酮的降解效率。(圖3，圖4)

通過以上實例，已經充分證明了本方法的可行性、有效性及便捷性，能夠以最少的成本，達到最好的海洋沉積物石油修復效果，該方法同樣適用于海洋其他有機污染的修復，只需篩選針對不同污染物的高效降解微生物即可。我國很多功能性海域/水域受污染十分嚴重，但是真正的海洋/淡水沉積物修復的案例并不多，也缺乏相應的指導方法。本方法很好的補充了這方面的不足。