磁性生物炭負載光合細菌材料的制備方法及污水處理方法與流程

本發明涉及污水處理技術領域，具體說是涉及一種耦合納米材料與微生物的技術，其應用于污水處理，能夠快速有效的降解COD、氨態氮與磷酸根。

背景技術：

隨著工農業的快速發展和生活污水的排放量日益增加，全球性水體污染日趨嚴重，威脅著社會經濟乃至人類自身的可持續發展。因此開發穩定性強、效率高、操作簡單的污水深度處理技術十分必要。有機物、氮和磷是水體主要污染源，目前主要的處理方法有吸附法、光催化氧化法、化學沉淀法和生物法等。這些方法各具優缺點，單一的處理方法不能高效的實現污染物的去除，需要多種方法耦合聯用，各自發揮優勢，才能更經濟有效的達到水體的凈化。因此本發明利用納米氧化鐵的高吸附性和光催化性以及光合細菌的強代謝活性，開發了一種綠色高效的污水處理技術。

光合細菌能夠以光作為能源，利用有機物、硫化物、氨等作為供氫體兼碳源進行光合作用，從而使廢水得以凈化。其在自然界中廣泛分布，應用于實際生產, 就有著非常重要的現實意義。光合細菌法能有效處理的廢水種類很多，迄今已成功實現了對糞尿、食品、淀粉、豆制品等污水的處理，其對COD去除率高，同時有脫氮除磷的效果。用游離態的光合細菌處理廢水，在大規模廢水處理過程中，存在諸多問題。如菌體細胞容易被流水沖走，即使在靜水條件下也可能被其他生物所吞噬，菌體不易回收重復利用。采用固定化微生物不僅能夠提高微生物的數量，提高處理負荷，能選擇地使光合細菌成為優勢菌群, 提高微生物活性、水質凈化效率和延長細菌使用時間。目前常用的微生物固定方法大多采用包埋及物理吸附類固定化方法。載體的特性與微生物的吸附量、結合緊密度、微生物活性和耐沖擊能力密切相關。研究較多的固定化材料則主要是瓊脂、角叉萊膠、海藻酸鈣等天然高分子凝膠載體，以及聚丙烯酰胺 (PAM)、聚乙烯醇 (PVA)、聚丙烯酸等有機合成高分子凝膠載體。這些載體材料水溶性大、穩定性差、機械強度不佳，使得固定化微生物處理污水的實際應用受到限制。其它用作載體的多孔材料如活性炭、沸石、陶瓷球、石英砂等雖各有特點，但存在孔隙率低、比表面積小、比重大等缺點。因此選擇適宜的載體，既有利于所固定微生物的代謝增殖，又呈現優良的傳質性能，還能提高所得固定化微生物的穩定性能是光合細菌應用于污水處理的一個重要方面。

技術實現要素：

為了克服現有技術中的上述缺陷，本發明的目的在于提供一種利用磁性生物炭負載光合細菌材料的污水處理方法，該方法耦合納米材料與微生物發酵技術，具有高效的降解COD、氨態氮和磷酸根能力。本發明的另一目的在于提供一種磁性生物炭負載光合細菌材料的制備方法，將大量微生物有效的固定在納米載體材料上。本發明的另一目的在于提供一種上述磁性氧化鐵納米材料負載光合細菌用于污水處理后，采用磁吸附回收再利用的方法。

為了實現上述發明目的，本發明采用如下技術方案：

本發明所述光合細菌選擇紫色非硫光合細菌屬的沼澤紅假單胞菌( Rhodopseudomonas palustris, R. palustris )，為本實驗室保藏。所述納米材料為磁性氧化鐵納米顆粒（Fe₃O₄），為本實驗室自制。二者耦合用于污水中COD、氨態氮和磷酸根去除。

磁性生物炭負載光合細菌材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

通過化學共沉淀法制備磁性納米氧化鐵材料，進行光合細菌的活化和擴大培養，通過自組裝的方法將納米氧化鐵粒子負載于生物炭材料表面形成磁性生物炭，通過共孵育的方法使磁性生物炭表面負載光合細菌得到磁性生物炭負載光合細菌材料。

磁性生物炭負載光合細菌材料的制備方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

（1） 磁性氧化鐵納米材料和生物炭的制備：按照Fe³⁺和Fe²⁺摩爾比2:1條件投料到2M的鹽酸溶液；通氮氣攪拌條件下，將12.5%的 (CH₃) ₄NOH水溶液快速加入至鐵鹽溶液中，室溫反應后制得黑色的磁性Fe₃O₄納米顆粒，進行磁分離洗滌去除未反應的物質；將制得的Fe₃O₄納米顆粒分散于去離子水中，Fe₃O₄濃度為1-2 mg/mL；

將作物秸稈破碎成長度0.1-0.5 cm的碎塊，洗滌，將洗滌后的秸稈烘干，將干燥的秸稈置于容器中并放入馬弗爐中于300-600℃缺氧熱解20-100 min，熱解升溫速率設定為10-20℃/分鐘，馬弗爐輸出功率百分比為80%；冷卻至室溫后取出，然后用蒸餾水浸泡并離心，離心轉速3000-5000 rpm，時間為5-8 min，重復浸泡和離心過程至浸出液pH<8；對蒸餾水清洗后的材料進行烘干，過篩，獲得生物炭材料；

（2）磁性氧化鐵納米材料與生物炭結合：

按3：1-5：1（生物炭：Fe₃O₄納米顆粒）的質量比例，室溫下將生物炭與Fe₃O₄納米顆粒混合并攪拌2-5個小時，使Fe₃O₄納米顆粒充分吸附于生物炭表面；采用磁分離清洗獲得表面負載了納米氧化鐵的磁性生物炭。

（3）磁性生物炭材料固定光合細菌R. palustris：

活化沼澤紅假單胞菌R. palustris并擴大培養；

按5：1-7：1的質量比（指磁性生物炭與R. palustris菌懸液的質量比）將磁性生物炭與擴大培養得到的R. palustris菌懸液（4-6×10⁸ CFU/mL）混合，在 30 ℃條件下震蕩處理，使光合細菌均勻地在磁性生物炭的納米顆粒表面吸附和固定，最后采用磁性分離去除未游離的菌體，獲得磁性生物炭負載光合細菌材料。

在步驟（3）中，活化沼澤紅假單胞菌R. palustris并擴大培養的具體步驟為：配制R. palustris固體培養基（g/L）: NH₄Cl 1.2, Na₂ HPO₄0.5, MgCl₂ 0.2, NaCl 2, 牛肉膏2, 有機酸2, 瓊脂粉12；滅菌前pH調節到7.2；將保存在甘油中的R. palustris劃線于R. palustris固體培養基上，30℃下2400 lux 的白熾燈下光照培養3-5天;

挑取平板上大的菌落作為活化種子，將菌種接種于100 mL的R. palustris液體培養基（g/L）: NH₄Cl 1.2, Na₂ HPO₄0.5, MgCl₂ 0.2, NaCl 2, 牛肉膏2, 有機酸2, 滅菌前pH調節到7.2。同樣進行光照培養3-5天至OD600=0.6-1.0，獲得光合細菌的種子培養液；將種子培養液和液體培養基以1：3-1：5的接種量接種，30℃下2400 lux 的白熾燈下光照培養3-5天至對數生長期，檢測培養液中光合細菌的濃度為OD600=0.6-1.0； 取對數生長期的菌液，5000rpm離心15分鐘，取沉淀懸浮在生理鹽水中，獲得最終菌液濃度為4-6×10⁸ CFU/mL。

利用磁性生物炭負載光合細菌材料進行污水處理的方法，包括以下步驟：通過化學共沉淀法制備磁性納米氧化鐵材料，進行光合細菌的活化和擴大培養，通過自組裝的方法將納米氧化鐵粒子負載于生物炭材料表面形成磁性生物炭，通過共孵育的方法使磁性生物炭表面負載光合細菌得到磁性生物炭負載光合細菌材料；取磁性生物炭負載光合細菌材料0.1-0.5 g，加入100 mL人工污水中，所述的人工污水初始COD、NH₄⁺-N和PO₄^-分別為877 mg/L, 29.7 mg/L 和3.6 mg/L，混合均勻，30 ℃光照下以200-300 r·min^-1在恒溫震蕩箱中振蕩處理。

所述的污水為人工污水；將磁性生物炭負載光合細菌材料應用于人工污水的處理步驟為：取0.1-0.5g負載了光合細菌的磁性生物炭，與100 mL 人工污水混合，光照下輕微振蕩，每隔一定時間取水樣，過濾后測定其中COD、NH₄⁺和 PO₄^3-濃度，計算3種污染物的去除率。

磁性生物炭負載光合細菌材料重復利用方法為：處理污水后的磁性生物炭負載光合細菌材料用磁鐵進行分離。

相對于現有技術，本發明的有益效果為：本發明提供的一種納米技術與微生物發酵聯用的新技術，納米氧化鐵具有小尺寸效應、比表面效應、量子尺寸效應和超順磁性等特性，具有超強的吸附能力；與多孔的生物炭結合，形成磁性生物炭材料，能夠成為優異的微生物載體，固定化微生物，提高其微生物降解活性；氧化鐵具有促進微生物生長和提高其酶活的能力，能夠進一步促進其對污染物的降解；同時磁性生物炭材料對污染物具有良好的吸附性和催化降解能力。二者結合顯著提高微生物對污水的處理效果，充分發揮磁性生物炭和微生物這一體系對有機物的降解和脫氮除磷的能力。

附圖說明

圖1. 納米氧化鐵的透射電鏡圖片；

圖2. 空白生物炭的掃描電鏡圖片；

圖3.負載納米氧化鐵的生物炭的掃描電鏡圖片；

圖4.磁性生物炭對光合細菌R. palustris的負載的掃描電鏡圖片；

圖5. 不同處理下污水中COD、NH₄⁺和PO₄^3-的去除能力示意圖。

具體實施方式

以下結合具體實例進一步詳細描述本發明的技術方案，所述實施實例僅用于說明本發明而不是限制本發明。

隨著納米技術及材料的出現和迅速發展，將其與污水深度處理技術相結合已成為環保領域又一新的研究熱點，已有眾多納米材料作為微生物載體應用于污水處理領域。氧化鐵磁性納米材料作為新材料，以其優越的性能、獨特的優勢，備受青睞。選擇它與微生物結合用于污水處理，其優越性體現在：（1）具有較大的比表面積，所以具有很高吸附性能，能夠負載大量微生物。（2）經我們開展的研究發現，氧化鐵磁性納米材料是一種生物相容性良好的材料，對微生物沒有明顯的毒性，而且在一定程度上能夠促進微生物生長。（3）磁性氧化鐵納米材料又具有超強磁分離性能，在外磁場的作用下易從廢水中分離，可循環使用，有很好的經濟效益。（4）氧化鐵納米材料對微生物酶活有促進作用，研究發現氧化鐵納米材料對氫酶、鐵氧還蛋白氧化還原酶有提高其活性的功能，使微生物具有高的呼吸量，從而對有機物的代謝起到促進作用。（5）磁性氧化鐵納米材料本身作為具有良好的吸附和降解污染物的能力，已經在COD降解和重金屬離子吸附方面有了應用。由于磁性氧化鐵材料存在易團聚的問題，影響其應用，通過負載的方法可以提高其分散性。生物炭作為一種價廉綠色的吸附材料成為近年來的研究熱點，它具有高的比表面、多孔和多官能團的特點，能夠很好與納米氧化鐵結合。

根據以上分析，本發明制備了表面負載氧化鐵的磁性生物炭材料，二者結合具有良好的吸附和催化性能，將其與微生物耦合，將產生協同效應，提高污水的處理效率。一方面提高微生物的傳質和代謝活性；另外磁性生物炭材料自身具有較強吸附和降解污染物的能力。因此，磁性生物炭與微生物聯用在廢水處理中具有巨大的優勢，在污水生化處理領域展現出了廣闊高效的前景。

一. 沼澤紅假單胞菌R. palustris擴大培養：

（1）配制R. palustris固體培養基(g/L): NH₄Cl 1.2, Na₂ HPO₄0.5, MgCl₂ 0.2, NaCl 2,牛肉膏2, 有機酸2, 瓊脂粉12。滅菌前pH調節到7.2。將保存在甘油中的R. palustris劃線于R. palustris固體培養基上，30℃下2400 lux 的白熾燈下光照培養3-5天；

（2）挑取平板上大的菌落作為活化種子，將菌種接種于100 mL的R. palustris液體培養基（g/L）: NH₄Cl 1.2, Na₂ HPO₄0.5, MgCl₂ 0.2, NaCl 2, 牛肉膏2, 有機酸2, 滅菌前pH調節到7.2。同樣進行光照培養3-5天至OD600=0.6-1.0，獲得光合細菌的種子培養液；將種子培養液和液體培養基以1：3-1：5（體積比）的接種量接種，30℃下2400 lux 的白熾燈下光照培養3-5天至對數生長期，檢測培養液中光合細菌的濃度為OD600=0.6-1.0。

（3）取對數生長期的菌液，5000rpm離心15分鐘，取沉淀懸浮在生理鹽水中，獲得最終菌液濃度約為4-6×10⁸ CFU/mL。

二．磁性氧化鐵納米材料的制備：

本發明所述磁性氧化鐵納米顆粒由本實驗室自制，方法為化學共沉淀法，制得的納米氧化鐵粒徑在10 -20 nm左右。具體制備步驟如下：

按照Fe³⁺和Fe²⁺摩爾比2:1條件投料，用200ml的2M的鹽酸溶液超聲攪拌溶解54.05 g FeCl₃·6H₂O，加入3 L單層玻璃反應釜中，通氮氣攪拌。再用50 ml 2M的鹽酸溶液超聲條件下溶解27.80g FeSO₄·7H₂O，然后加入上述Fe³⁺溶液中。通氮氣攪拌條件下，用蠕動泵將1.25 L 12.5%（溶劑占溶液的質量分數）的(CH₃) ₄NOH水溶液快速加入至鐵鹽溶液中，室溫反應1h，制得黑色的磁性Fe₃O₄納米粒子，全程通氮氣保護，然后進行磁分離洗滌去除未反應的物質。將制得的Fe₃O₄納米顆粒分散于去離子水中，濃度約為1.2 mg/mL，在超聲振蕩儀中超聲30分鐘，使其分散均勻，冷藏保存待用。

三．磁性氧化鐵納米材料與生物炭結合

（1）將自然晾曬風干的小麥秸稈（或其他常見作物秸稈）破碎成長度約0.1-0.5 cm的碎塊，用去離子水對其進行反復洗滌，將洗滌后的秸稈置于60-100℃ 烘箱中烘干6-12 h，將干燥的秸稈置于坩堝等容器中，蓋好蓋子，放入馬弗爐中于300-600℃缺氧熱解20-100 min，高溫熱解采用逐步升溫方式，熱解升溫速率設定為10-20℃/分鐘，馬弗爐輸出功率百分比為80%。冷卻至室溫后取出，然后用蒸餾水浸泡并離心（轉速3000-5000 rpm，時間為5-8 min），重復該過程至浸出液pH<8；最后對清洗后的材料進行烘干，過60目篩，獲得生物炭材料。

（3）按3：1-5：1的質量比例，將生物炭與Fe₃O₄納米顆粒混合，室溫下在燒杯中機械攪拌2-5個小時，使納米氧化鐵充分吸附于生物炭表面。采用磁分離清洗獲得表面負載了納米氧化鐵的磁性生物炭材料。

四．磁性生物炭材料固定化光合細菌R. palustris，及二者耦合聯用進行污水中COD、氨態氮和磷酸根的去除。

（1）按5：1-7：1質量比將上述所得的磁性生物炭材料與R. palustris菌懸液（~4-6×10⁸ CFU/mL）在三角瓶中混合，在 30 ℃震蕩下，使細菌均勻地在納米顆粒表面吸附和固定，分別在0min、5min、10min 、20min 、30min 、45min 、60min時用紫外分光光度法在600nm 波長下檢測吸附前后菌液的吸光度變化，計算吸附率并通過血球計數法計算出菌株個數。最后采用磁性分離去除未游離的菌體，獲得了負載了R. palustris的磁性生物炭復合材料。

（2）人工配制污水：成分為葡萄糖, NH₄Cl, KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O, NaHCO₃, CaCl₂·2H₂O，使得初始COD、NH₄⁺-N和PO₄^-為877 mg/L, 29.7 mg/L 和3.6 mg/L。

（3）取步驟（1）所獲得的負載型的光合細菌（0.1-0.5g），加入100 mL待處理的人工配制污水中，混合均勻，30 ℃光照下以200-300 r·min^-1在恒溫震蕩箱中振蕩處理。對測試樣品定期取樣（2h，6h，12h，18h，24h，48h），評估實際修復效果。并在同樣處理條件下，設置了空白、游離光合細菌和磁性生物炭材料處理污水的對照組。

水質指標按相關國家標準測定：COD分析采用重鉻酸鉀法，氨態氮按納氏試劑比色法，磷酸根測試方法為鉬藍比色法。

（4）將上述處理污水后的Fe₃O₄/生物炭/光合細菌用磁鐵進行分離，在同樣的條件下，多次重復使用進行污水處理，考察其循環使用的能力。

實施例1

1.以化學共沉淀法，制得粒徑在10nm左右的納米氧化鐵粒子（圖1）。

以厭氧高溫熱解法，制備生物炭材料，為多孔炭材料（圖2）。

通過自組裝的方式，將納米氧化鐵粒子負載于生物炭材料表面，獲得表面均勻搭載納米氧化鐵、具有磁性的復合生物炭材料（圖3）。

通過共孵育是方法，將光合細菌R. palustris負載與磁性生物炭表面，磁性生物炭對微生物的吸附很快，在2小時內負載量為5.45×10⁹ (cfu/g)，負載率90.8%。（圖4）

具體過程為：沼澤紅假單胞菌R. palustris擴大培養：

（1）配制R. palustris固體培養基(g/L): NH₄Cl 1.2, Na₂ HPO₄0.5, MgCl₂ 0.2, NaCl 2,牛肉膏2, 有機酸2, 瓊脂粉12。滅菌前pH調節到7.2。將保存在甘油中的R. palustris劃線于R. palustris固體培養基上，30℃下2400 lux 的白熾燈下光照培養3-5天；

（2）挑取平板上大的菌落作為活化種子，將菌種接種于100 mL的R. palustris液體培養基（g/L）: NH₄Cl 1.2, Na₂ HPO₄0.5, MgCl₂ 0.2, NaCl 2, 牛肉膏2, 有機酸2, 滅菌前pH調節到7.2。同樣進行光照培養3-5天至OD600=0.6-1.0，獲得光合細菌的種子培養液；將種子培養液和液體培養基以1：3（體積比）的接種量接種，30℃下2400 lux 的白熾燈下光照培養3-5天至對數生長期，檢測培養液中光合細菌的濃度為OD600=0.6-1.0。

（3）取對數生長期的菌液，5000rpm離心15分鐘，取沉淀懸浮在生理鹽水中，獲得最終菌液濃度為5.8 ×10⁸ CFU/mL。

二．磁性氧化鐵納米材料的制備：

本發明所述磁性氧化鐵納米顆粒由本實驗室自制，方法為化學共沉淀法，制得的納米氧化鐵粒徑在10 nm左右。具體制備步驟如下：

按照Fe³⁺和Fe²⁺摩爾比2:1條件投料，用200ml的2M的鹽酸溶液超聲攪拌溶解54.05 g FeCl₃·6H₂O，加入3 L單層玻璃反應釜中，通氮氣攪拌。再用50 ml 2M的鹽酸溶液超聲條件下溶解27.80g FeSO₄·7H₂O，然后加入上述Fe³⁺溶液中。通氮氣攪拌條件下，用蠕動泵將1.25 L 12.5%（溶劑占溶液的質量分數）的(CH₃) ₄NOH水溶液快速加入至鐵鹽溶液中，室溫反應1h，制得黑色的磁性Fe₃O₄納米粒子，全程通氮氣保護，然后進行磁分離洗滌去除未反應的物質。將制得的Fe₃O₄納米顆粒分散于去離子水中，濃度約為1.2 mg/mL，在超聲振蕩儀中超聲30分鐘，使其分散均勻，冷藏保存待用。

三．磁性氧化鐵納米材料與生物炭結合

（1）將自然晾曬風干的小麥秸稈破碎成長度約0.1-0.5 cm的碎塊，用去離子水對其進行反復洗滌，將洗滌后的秸稈置于60-100℃ 烘箱中烘干6-12 h，將干燥的秸稈置于坩堝等容器中，蓋好蓋子，放入馬弗爐中于300-600℃缺氧熱解20-100 min，高溫熱解采用逐步升溫方式，熱解升溫速率設定為10-20℃/分鐘，馬弗爐輸出功率百分比為80%。冷卻至室溫后取出，然后用蒸餾水浸泡并離心（轉速3000-5000 rpm，時間為5-8 min），重復該過程至浸出液pH<8；最后對清洗后的材料進行烘干，過60目篩，獲得生物炭材料。

（3）按3：1的質量比例，將生物炭與Fe₃O₄納米顆粒混合，室溫下在燒杯中機械攪拌2個小時，使納米氧化鐵充分吸附于生物炭表面。采用磁分離清洗獲得表面負載了納米氧化鐵的磁性生物炭材料。

四．磁性生物炭材料固定化光合細菌R. palustris，及二者耦合聯用進行污水中COD、氨態氮和磷酸根的去除。

（1）按5：1質量比將上述所得的磁性生物炭材料與R. palustris菌懸液在三角瓶中混合，在 30 ℃震蕩下，使細菌均勻地在納米顆粒表面吸附和固定，分別在0min、5min、10min 、20min 、30min 、45min 、60min時用紫外分光光度法在600nm 波長下檢測吸附前后菌液的吸光度變化，計算吸附率并通過血球計數法計算出菌株個數。最后采用磁性分離去除未游離的菌體，獲得了負載了R. palustris的磁性生物炭復合材料。

5. 以人工配制的模擬污水為處理對象，應用磁性生物炭與光合細菌R. palustris對污水中的COD、氨態氮和磷酸根進行去除。取約0.1g負載了光合細菌的磁性生物炭，與100 mL 人工污水混合，光照下輕微振蕩，每隔一定時間取水樣，過濾后測定其中COD、NH₄⁺和 PO₄^3-濃度，計算3種污染物的去除率。

（1）COD去除效果：光合細菌R. palustris通過光合磷酸化降解有機物，因此對水中COD 的去除率為62.2 %，磁性生物炭通過吸附和催化作用對COD去除率為66.6%，而負載了光合細菌的磁性生物炭對COD去除率明顯提高可達83.1%。說明磁性生物炭與光合細菌聯用，具有協同作用，促進微生物代謝活性，從而強化了COD 的去除效果，見圖5。

（2）NH₄⁺去除效果：光合細菌R. palustris通過菌體對氨氮同化利用，從而達到降低氨氮濃度的作用，通過同化水體中60.9%的氨氮被光合細菌去除，磁性生物炭通過吸附和催化作用對氨氮有52.1%的去除率，而磁性生物炭與光合細菌聯用，對氨氮的去除提高到了85.9%，說明磁性生物炭負載光合細菌后，對氨氮吸附和同化加強，見圖5。

（3） PO₄^3-去除效果：與氨氮類似，光合細菌R. palustris通過同化作用利用磷酸根，因此，對PO₄^3-有62.6%的去除能力，磁性生物炭則體現出對磷酸根超強的吸附能力，并且吸附速度很快，在20分鐘內可以達到92.2 %的去除率，這一方面是由于氧化鐵與磷酸根較強的靜電吸附作用，此外磷酸根能與氧化鐵形成配合體，從而能夠穩定的吸附于氧化鐵的表面和內部，磁性生物炭與光合細菌聯用后，也體現了一定的促進效果，對PO₄^3-的去除率為94.2%，見圖5。

（4）重復利用能力：光合細菌R. palustris負載于磁性生物炭后，其穩定性提高，通過磁性就可以簡單的回收再利用。將進行污水處理后的復合體用磁鐵分離，在加入100 mL人工污水，在同樣條件下反應，結果發現重復使用5次，該方法仍具有很強的污水處理能力，見圖5。

本發明通過納米磁性氧化鐵的高比表面以及和表面帶有電荷的細菌之間通過靜電力結合來實現菌株的固定化，同時磁性氧化鐵材料對菌株的酶活有活化作用，從而增強了微生物對COD、氨態氮和磷酸根的降解能力，提高了污水處理效率和穩定性，具有重要的實際應用價值。

以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和優點。本行業的技術人員應該了解，上述實施例不以任何形式限制本發明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術方案，均落在本發明的保護范圍內。