精胺在提高植物凈化甲醛污染中的應用的制作方法

本發明屬于植物凈化環境污染的領域，涉及精胺的新用途，具體為精胺在提高植物凈化甲醛污染中的新用途。

背景技術：

煙草（Nicotiana tabacum L.）是一種在我國種植廣泛的經濟作物。煙草葉片較大，氣孔數目多，氣孔較大，是吸收環境中甲醛的極佳的植物材料。作為模式已經被廣泛研究，用¹³C標記的H¹³CHO處理煙草葉片經¹³C-NMR分析結果說明甲醛在煙草葉片中代謝產生四種有機酸[4-¹³C]Asn、[3-¹³C]Gln、[U-¹³C]OA和H¹³COOH，沒有糖類物質產生。煙草代謝HCHO的途徑可概括為：HCHO進入煙草細胞后，在細胞質溶膠中首先與GSM（谷胱甘肽）結合形成了加合物HM-GSH（S-羥甲基谷胱甘肽），在FALDH（甲醛脫氫酶）催化下產生Forml-GSH（甲酰谷胱甘肽），隨后在ESD（甲酰基谷胱甘肽水解酶）作用下生成甲酸，然后擴散進入葉綠體中，在GOS（乙醛酸合成酶）作用下生成Glyoxylic acid（乙醛酸），乙醛酸進入過氧化物酶體，被GO（乙醇酸氧化酶）氧化為OA（草酸），草酸進入細胞質溶膠中被OCS（草酰胺-CoA合成酶）催化生成Oxalyl-CoA（草酰-CoA），進而形成CO₂，與PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）在PEPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）作用下形成OAA（草酰乙酸），OAA最終進入線粒體中的TCA循環，終產物為Gln或Asn。

葉綠體與植物的光合作用密切相關并在植物甲醛代謝中發揮著非常重要的作用，葉綠素的含量直接反應葉綠體的受破壞程度，當植物受到環境中的甲醛脅迫時，植物會出現病變并加速衰老，最明顯的表現之一是植物葉綠體遭到破以及葉綠素的分解加速和含量快速下降，通過測定葉綠素含量，能反映出植物在逆境脅迫下的生命活力。植物的器官在衰老或者受到甲醛的脅迫時，由于體內活性氧代謝加強，而使過氧化氫（H₂O₂）和丙二醛(MDA)產生積累，并發生膜脂過氧化作用。H₂O₂可以直接或間接的氧化細胞內核酸、蛋白質等生物大分子，并使細胞膜遭受損害，從而加速細胞的衰老或者解體。MDA是自由基進行膜脂過氧化作用過程中的最終產物之一，丙二醛和酶結合、交聯使之失活從而導致細胞膜作用的紊亂，以至于生物膜的結構和功能被破壞。MDA和H₂O₂通常被作為質膜過氧化指標，用來表示細胞膜脂過氧化程度與植物在逆境下遭受傷害反應的強弱。植物體內這兩種物質積累越多，說明植物受損害越嚴重。SOD、CAT、POD 、APX等統稱為保護酶系統，保護酶體系清除活性氧的能力是決定植物對脅迫抗性的關鍵因素。植物受到甲醛脅迫時，體內主要利用抗氧化酶系統來清除活性氧，來解除或者減少甲醛脅迫對植物的損害。

多胺作為一類植物激素，具有調節植物的生長發育和延緩植物細胞衰老等生理功能，當植物遭遇逆境脅迫時，植物體內多胺不僅可以通過歧化反應直接清除活性氧, 而且還可以通過提高抗氧化酶活性來減少活性氧的積累。精胺是含有兩個氨基和兩個亞氨基的多胺類物質，在植物體內由丁二胺和S-腺苷蛋氨酸經一系列酶促反應后生成。

技術實現要素：

本發明目的在于提供一種提高植物凈化環境中甲醛污染能力促進劑，即精胺（Spermine）在植物凈化甲醛污染中的應用。

本發明的上述目的是通過下述的技術方案得以實現的：

1、野生型煙草（Nicotiana tabacum L.）的繼代培養與取材

在超凈工作臺中繼代無菌的野生型煙草于含有 MS 固體培養基的組培瓶中,于恒溫 25℃、24 h 光照的組培室中培養30天后，剪取大小和顏色相近的煙草葉片用于實驗。

2、不同濃度梯度精胺促進煙草葉片吸收甲醛的研究

設置不同實驗組使4 mmol/L的甲醛溶液中精胺濃度分別為0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L，每個實驗組浸泡2g新鮮的煙草葉片于甲醛溶液，100 μmol·m^-2·s^-1光照，搖床轉速100 r·min^-1進行實驗，在6 h、12 h、24 h、48 h、72 h時分別測定剩余的甲醛含量；并在煙草葉片處理72小時后分別測定其葉綠素a和葉綠素b的含量；從而篩選出精胺的最佳添加濃度。

3、最適濃度的精胺刺激48h后煙草葉片生理生化指標的的測定

取2g新鮮煙草葉片加入到含有最適精胺濃度的4 mmol/L 的甲醛溶液中，于100 μmol·m^-2·s^-1光照，搖床轉速100 r·min^-1下處理48小時，設置三組重復，處理后測定煙草葉片過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，以及煙草葉片中過氧化氫（H₂O₂）含量和丙二醛（MDA），以確定精胺刺激對煙草葉片抗氧化酶含量的影響以及煙草葉片過氧化的程度，為精胺促進植物對甲醛的代謝確定生理依據。

本發明提供的精胺作為提高植物環境中甲醛污染能力的促進劑，具有使用方便，成本很低，實用性強，開辟了用調節劑提高植物凈化甲醛污染的一條途徑，有助于科研工作者對精胺提高植物凈化甲醛污染能力分子機理的研究，為科研工作者研究植物中精胺與14-3-3蛋白相互作用提供了一定的理論支持；該調節劑顯著提高了植物凈化水體中甲醛污染的能力，在環境保護和水污染防治領域具有廣闊的前景，煙草作為科研中的模式植物，實驗結果有一定代表性，也為將這一發明應用到其他植物凈化水體中甲醛污染提供了新的思路。

本發明的有益效果：本發明所述的提高植物凈化甲醛污染能力的促進劑，具有投入低、操作簡單、效率高的特點，并能顯著提高了植物凈化水體中甲醛污染的能力。在環境保護和水污染防治領域具有廣闊的前景。常溫下，精胺是比較理想的植物凈化水體中甲醛污染的促進劑，精胺刺激煙草葉片可以提高煙草葉片中與甲醛代謝相關的酶的活性，從而提高甲醛吸收率，對水體中甲醛污染防治具有重要意義。煙草作為科研中的模式植物，實驗結果有一定代表性，也為將這一發明應用到其他植物凈化水體中的甲醛污染提供了新的思路。本發明有助于科研工作者對精胺提高植物凈化甲醛污染能力分子機理的研究以及植物中精胺與14-3-3蛋白相互作用并調節相關抗氧化酶的活性的研究提供了一定的理論支持。

附圖說明

圖1為不同精胺濃度激煙草葉片，在4 mmol/L HCHO溶液中不同時間點HCHO剩余量的測定結果；圖中對照表示組培瓶中只加入4 mmol/L HCHO溶液，并未加入煙草葉片，也未加入精胺；0-200 μmol/L表示組培瓶中加入的4 mmol/L HCHO溶液中所含的精胺濃度；

圖2為在4 mmol/L HCHO溶液中，不同濃度精胺刺激煙草葉片72 h后煙草葉片中的葉綠素a含量（A圖）和葉綠素b含量（B圖）；

圖3為在4 mmol/L HCHO溶液中，未用精胺刺激以及最佳濃度（100 μmol/L）精胺刺激煙草葉片后MDA含量（A圖）和H₂O₂含量（B圖），圖中對照表示未經任何處理的新鮮煙草葉片；甲醛（24）和甲醛（48）分別表示未加入精胺的4 mmol/L HCHO溶液處理煙草葉片24 h和48h后所測得結果；精胺（48）表示含100 μmol/L 精胺的4 mmol/L HCHO溶液處理煙草葉片48h后所測得結果；

圖4為在4 mmol/L HCHO溶液中，未用精胺刺激以及最佳濃度（100 μmol/L）精胺刺激煙草葉片后APX活性（A圖）、CAT活性（B圖）；

圖5為在4 mmol/L HCHO溶液中，未用精胺刺激以及最佳濃度（100 μmol/L）精胺刺激煙草葉片后POD活性（A圖）、SOD活性（B圖）。

具體實施方式

下面通過實施例和附圖對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容。實施例中方法如無特殊說明，按常規操作進行，如無特殊說明使用試劑均為常規購試劑或按常規方法配制的試劑。

實施例1：野生型（WT）煙草的無菌培養與處理，步驟如下：

1、配制MS固體培養基，于超凈工作臺中倒入組培瓶，待培養基凝固后，剪取帶有葉片的無菌培養的野生型煙草莖部3～5cm 插入培養基，于25℃恒溫光照培養，培養30天后，剪取大小顏色相近的煙草葉片用于本實驗；

2、配制含有不同濃度（0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L）精胺的4 mmol/L 的 HCHO 處理液；

3、將上述濃度梯度的處理液各100 mL加入含有2g新鮮野生型煙草葉片的組培瓶中,使葉片完全浸于處理液中；同時以不加的葉片的4 mmol/L 的HCHO溶液作為對照檢測HCHO的揮發程度，樣品置于照度為100 μmol·m^-2·s^-1日光燈下，同時在搖床上振蕩(100 r·min^-1)處理。

實施例2：不同HCHO處理液在不同時間點剩余HCHO含量的測定,以及處理72 h后葉片中剩余葉綠素含量的測定。

1、甲醛剩余量測定的步驟如下：在處理的不同時間點(6、12、24、24、48、72 h)，各取1 mL處理液，用Nash法測定處理液中殘留HCHO的含量；溶液剩余甲醛含量=處理液中殘留甲醛的含量/處理液起始的甲醛含量×100%；對照 CK中甲醛揮發量=處理液起始的甲醛含量–CK中溶液剩余甲醛含量（圖1）。

從圖1可以看出處理與對照相比，隨著時間的推移，溶液中HCHO的剩余量都有所下降，這說明煙草對HCHO有一定的吸收，精胺刺激煙草葉片對煙草葉片吸收甲醛有顯著的促進作用。在100 μmol/L的精胺刺激下，處理時間為72 h時，溶液中HCHO的剩余量已經低于20%，且高于和低于100 μmol/L的精胺處理對照組中煙草葉片吸收甲醛的作用均有所下降，所以取100 μmol/L為后續實驗添加精胺的最佳濃度。

2、葉綠素含量測定步驟如下:

（1）取上述實驗處理 72 h 后的煙草葉片,用預冷無菌蒸餾水沖洗葉片 4-5 次,用紙巾吸干葉片表面殘留的蒸餾水,然后用 95 %乙醇提取葉綠素,用紫外分光光度法測定 665 nm 和 649 nm 處的光吸收值 OD₆₆₅ 和 OD₆₄₉,根據下述公式計算總葉綠素、葉綠素a和b的含量。

（2）根據以下公式計算葉綠素含量，葉綠素a含量(mg·g^-1) =13.95×A₆₆₅–6.88×A₆₄₉; 葉綠素 b含量(mg·g^-1)=24.96×A₆₄₉–7.32×A₆₆₅;葉綠素含量[mg·g^-1 (FW)]=(色素濃度×提取液體積×稀釋倍數)/(樣品鮮重×1 000)。（見圖2）。

從圖2A可以看出，HCHO溶液中所添加的精胺濃度與處理72 h后的煙草葉片中葉綠素a的含量無明顯相關性，在精胺濃度為100 μmol/L時，葉綠素a的含量剩余稍微多余其他對照組。從圖2 B中可以看出葉綠素b的剩余量在溶液中精胺濃度為100 μmol/L為最多，這與（圖1）中100 μmol/L精胺刺激的煙草葉片吸收甲醛效果最顯著的實驗結構是一致的，且葉綠素b的含量差異較圖2 A的更顯著，對葉綠素b有較明顯的保護作用。

實施例3：含有100 μmol/L 精胺的HCHO處理液處理煙草葉片后葉片氧化脅迫指標的測定

1、用含有100 μmol/L 精胺的HCHO處理液處理煙草葉片，取處理48 h的葉片，并用不加精胺的HCHO處理液處理煙草葉片，同樣取處理時間為24 h和48 h的葉片。以未作任何處理的新鮮煙草葉片作為對照。處理后，用預冷無菌蒸餾水沖洗葉片4-5次，去除葉片表面HCHO，無菌吸水紙吸干葉片表面水分，取上述樣品各0.2 g加入1 mL酶提取液（50 mM，pH7.8的磷酸緩沖液，1 mM EDTA；1 mM AsA ；1% PvP），冰浴研磨成勻漿液，轉入2 mL EP管，再加入1 mM提取液清洗研缽，并合并轉入EP管，4 ℃，12000 rpm 離心20 min。離心后取上清于4 ℃保存備用。

2、丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法來測定：在 0.4 mL含有0.6% TBA(硫代巴比妥酸)20% TCA (三氯乙酸)的溶液中加入0.4 mL抽提液,沸水浴15 min后即刻置于冰上冷卻。(12000 rpm/10 min), 讀上清液的光吸收值OD₅₃₂和OD₄₅₀。代入公式中:MDA 濃度(μmol/L)= 6.45×OD₅₃₂-0.56×OD₄₅₀ 從而計算MDA的濃度（圖3A）。

MDA是膜脂過氧化的產物之一，其含量反應了膜脂過氧化的程度。從圖3A可以看出，未給予精胺刺激時煙草葉片在HCHO溶液中浸泡48 h后，葉片中MDA含量與未處理的新鮮葉片相比都有所增加，浸泡48小時后增加的更為顯著，在含有100 μmol/L精胺的HCHO中，MDA含量在葉片處理48 h后同樣比CK₀有所增加，但是MDA的增加量卻顯著低于未給予精胺刺激且處理48 h的葉片。這說明精胺刺激延緩了煙草葉片的過氧化。

3、過氧化氫(H₂O₂)的含量的采用二甲酚橙法測定

（1）用 MiliQ 水來配制試劑 A(3.3 mM FeSO₄，3.3 mM (NH4)₂SO₄，412.5 mM H₂SO₄)與試劑 B(165 μM 二甲酚橙,165 mM 山梨醇)。使用前需將試劑 A 與試劑 B 按照 1:10 的比例混合后成為工作試劑。此工作試劑和 H₂O₂ 待測液按照 2:1 的比例混合后,水浴 30℃顯 色 30 min 后,測定其 560 nm 處光吸收值 OD₅₆₀。

（2）H₂O₂的含量參照標準曲線 y=0.1734x-0.0055(x:H₂O₂ 濃度(mg/mL), y:OD₅₆₀,R²=0.9995) 計算（圖3B）。

H₂O₂是細胞過氧化的指標之一，從圖3B中可以看出在HCHO溶液中浸泡處理相同時間的煙草葉片，有精胺刺激的煙草葉片細胞的H₂O₂含量低于處理相同時間的未給予精胺刺激的煙草葉片，甚至低于未給予精胺刺激處理24 h的葉片，只是略高于對照，這同樣說明精胺刺激減緩了煙草葉片細胞的過氧化程度。

實施例4：含有100 μmol/L 精胺的甲醛處理液處理后煙草葉片抗氧化酶活性的測定

1、抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)活性的測定采用Nakano的方法

（1）取酶提取液 100μL，加入 3 ml 反應液(56 ul 30% H₂O₂ 1 mM，0.024 g ASA(抗壞血酸,0.25 mM),0.02 g EDTA-Na₂ (0.1mM),在 0.05 mol/L 的磷酸鹽緩沖液中溶解),空白對照不加樣品,加 100μL ddH₂O，在分光光度計 290 nm下測吸光度,每隔 1 min 讀一次吸光值,測定 3 min。

（2）計算方法:APX 總活性(U.g^-1FW)=(ΔOD₂₉₀ × V)/(a × W× t); a為反應時上樣體積，W 為樣品鮮重，t為時間1 min（圖4 A）。

從圖4 A可以看出，與新鮮煙草葉片相比，經HCHO處理的煙草葉片APX活性都有所下降，精胺刺激的48小時的葉片APX活性只是略高于未用精胺處理的對照組，說明精胺刺激對APX的活性的影響很小，可能精胺提高煙草葉片吸收HCHO的能力與提高APX活性的相關性不大。

2、過氧化氫酶(CAT)活性測定根據Aebi的方法有所修改：反應液:0.1 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖 液100 mL中加入0.1mol/L H₂O₂ 25 ml,用蒸餾水定容至 500 ml。取 100μL研磨提取的上清酶液,對照中加 入100μL磷酸緩沖液,加入 3 mL 上述的反應液,馬上在用分光光度計測定240 nm下的吸光度值,每隔30秒讀一次值,測定 3 min。酶活計算參考APX的酶活計算方法（圖4 B）。

從圖4 B中可以看出與新鮮葉片中CAT活性相比，HCHO處理過的煙草葉片CAT活性都有所提高，推測可能是CAT在煙草葉片甲醛的代謝中發揮了重要的作用，甲醛脅迫使CAT基因的表達上調，從而使葉片細胞中H₂O₂的代謝加快，減緩了煙草葉片的過氧化程度，所有實驗組中精胺刺激的實驗組CAT活性提高最為顯著，說明精胺的刺激促進了CAT活性的上調。

3、過氧化物酶(POD)活性測定參照Chance的愈創木酚方法改進

反應液配制:加入加熱溶解的愈創木酚56μL于100 mL的0.1 mol/L，pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中，加熱溶解，冷卻后加入 38μL 30% H₂O₂,混勻,存放在4℃冰箱中。取 20μL提取的樣品上清,加入3 mL 反應液,在分光光度計中測 470 nm下的吸光值, 每隔30秒讀一次,活性測定3 min。計算方法同APX 的方法（圖5A）。

從圖5A中可以看出，與新鮮煙草葉片相比HCHO脅迫在最初降低了POD的活性，隨著脅迫處理時間的增加到48 h時POD的活性有所恢復，處理48 h的實驗組中精胺刺激組略高于未用精胺刺激的實驗組，說明精胺刺激煙草葉片在一定程度上加快POD活性的恢復，這說明精胺刺激有助于提高煙草葉片POD活性的增強，進而促進煙草葉片對HCHO的代謝。

4、超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定參照 Gianopolitis 的氮藍四唑(NBT)的方法

（1）反應液的配制:14.5 mmol/L 甲硫氨酸，30 mmol/L EDTA-Na₂，2.25 mmol/L 氮藍四唑(NBT)，60 umol/L 核黃素。

SOD的活性測定是在光照下反應體系中產生氧自由基將硝基四唑藍還原成藍色物質,并且在 560 nm 處有最大吸光度，SOD 能與氧自由基反應,從而清除氧自由基抑制上述反應。SOD活性測定操作取 4 mL EP管,加入 50μL 提取的上清液(2支對照管中加磷酸緩沖液 50 μL)然后再加入 3 mL 反應液,其中一支對照管放于暗處,其 余各管放置于4000 lux日光下反應 20 min，反應結束后將各反應樣品管放于暗處,以一開始置于暗處的對照 管作空白對照,用分光光度計測定560 nm處的吸光值。

（2）計算:以抑制NBT光化學還原50%時所需要的酶量為一個酶活單位(U)。SOD總活力(U?g^-1FW)=[(照光對照管的吸光度-樣品管的吸光度) ×樣品液總的體 積]/(0.5×照光對照管的吸光度×樣品鮮重×樣品的上樣量) （圖5B）。

從圖5B中可以看出，SOD的活性在新鮮煙草葉片中與甲醛脅迫后的葉片中變化并不明顯，精胺刺激對SOD活性的提高只有微弱的作用。推測可能，SOD在煙草葉片清除H₂O₂的積累并沒有發揮顯著作用，而是主要依靠圖4B和5A中CAT以及POD的活性來清除H₂O₂的積累。