熒光探針及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種汞離子(Hg2+)檢測劑，具體涉及一種基于基于含雙碳硫鍵結構羅 丹明的Hg2+熒光探針的制備方法。
【背景技術】
[0002] 汞是生物體和環境中常見的污染物之一，汞在常溫下以液態的形式存在，具備較 強的揮發性，給生態系統帶來較大的危害。汞主要以無機汞和甲基汞的形式進入生物體中， 并在生物體內富集。汞離子具備較強的嗜硫性，過量的汞離子與生物體內含S的蛋白質或者 酶發生反應，從而引起一系列的疾病。對生物體的神經系統和正常代謝活動造成極大的傷 害，如汞離子過量可以導致不可逆的DNA損傷、心肌梗塞、中樞神經紊亂以及多種類型的自 閉癥等癥狀。正是由于汞離子的劇毒性，世界上多個國家和相關組織均對汞離子在飲用水 和食品中的含量做了嚴格的要求，如美國環保局(EPA)就嚴格規定在飲用水中的汞離子含 量不得超過2ppb。近年來，實時監測生物體和環境中的汞離子含量成為一個重要的研究領 域。熒光探針由于具有成本較低、操作儀器簡單、檢測限低、實時監測等優點，熒光探針法檢 測金屬離子近年來受到廣泛關注。
[0003] 基于"turn-on"機理的焚光傳感材料可減少檢測錯誤，對復雜體系檢測更準確，按 機理它分為焚光化學傳感器（fluorescentchemsensor)和焚光化學劑量計 (fluorescentchemodosimeter)兩種類型。其中，焚光化學劑量計由于可以和目標分析物發 生不可逆的化學反應，對分析物表現出高選擇性，逐漸突顯出其在重金屬離子檢測中的優 勢。汞離子熒光化學劑量計主要是利用汞離子與硫羰基發生脫硫反應以及與端基炔或烯烴 發生羥汞化反應實現對汞離子檢測。羥汞化反應由于反應活性較低，常常需要較高的反應 溫度或較長的反應時間，限制了它的應用。基于脫硫反應的汞離子熒光化學劑量計具有響 應速度快、常伴有比色分析等特點，越來越受到人們的關注。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提出一種基于含雙碳硫鍵結構羅丹明的Hg2+熒光探針的制備方 法。
[0005] 本發明提出的一種基于含雙碳硫鍵結構羅丹明的Hg2+熒光探針的制備方法，首先 由商品化的羅丹明B與半胱胺鹽酸鹽進行縮合酰化反應，得到一種羅丹明B-半胱胺衍生物 (RhB-SH);該羅丹明B-半胱胺衍生物(RhB-SH)經過勞森試劑硫化得到含碳硫鍵的中間體 (S-RhB-SH);該含碳硫鍵的中間體(S-RhB-SH)與間苯二甲酰氯進行酰氯化反應得到一種含 雙碳硫鍵結構羅丹明的化合物，該化合物在甲醇-水溶液中可以用做Hg 2+的高選擇性熒光探 針。
[0006] 本發明提出的一種基于含雙碳硫鍵結構羅丹明的Hg2+熒光探針的制備方法，其具 體合成路線如下所示：
[0008] (1)將羅丹明B溶于無水1，2-二氯乙烷中，冰浴條件下滴加入一定量的三氯氧磷， 冰浴下反應1小時，改為回流反應3小時，減壓去除溶劑，得到羅丹明酰氯RhB-Cl。將羅丹明 酰氯RhB-Cl溶于無水乙腈中，冰浴條件下過量半胱胺鹽酸鹽的乙腈溶液滴加入上述體系 中，待反應完全后使反應體系升溫至室溫，減壓除去溶劑，用乙酸乙酯重新溶解，用純水和 飽和氯化鈉溶液洗滌，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓除去溶劑，硅膠柱層析分離得 到中間產物RhB-SH。
[0010] ⑵將中間體RhB-SH和勞森試劑溶于無水甲苯，加熱回流至反應完全，減壓蒸餾濃 縮除去甲苯，濃縮物用CH2C12溶解，飽和食鹽水洗滌，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮后 硅膠柱層析分離得到中間體S-RhB-SH。
[0012] (3)將中間體S-RhB-SH與三乙胺混合于二氯甲烷溶液中，冰浴條件下滴加入間苯 二甲酰氯的二氯甲烷溶液，滴加完畢后該為室溫反應，反應完全后，飽和氯化鈉溶液洗滌， 有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓除去溶劑，用二氯甲烷和甲醇作為洗滌劑，經硅膠柱 層析分離得到產物HgPl。
[0014]所述步驟（1)中，羅丹明B與三氯氧磷的物質的量之比為1:3-8,所述冰浴條件溫度 為〇°C以下，回流反應溫度為80-90°C，反應時間為4-7小時，羅丹明酰氯RhB-Cl與半胱胺鹽 酸鹽的物質的量之比為1:3-5，反應時間為5-8小時，產率為60-80%。
[0015] 所述步驟⑴中，硅膠柱分離的洗脫液為CH2C12和CH30H，所述CH 2C12與CH30H的體積 比為 20-30:1。
[0016]所述步驟(2)中，中間體RhB-SH與勞森試劑的物質的量之比為1:2-5，所用甲苯需 經無水處理，所述加熱回流反應溫度為105-120°C，反應時間為10-15小時，硅膠柱分離的洗 脫液為CH2C1 2和CH30H，所述CH2C12與CH30H的體積比為8-20:1，產率為15-30%。
[0017] 所述步驟⑶中，硅膠柱分離的洗脫液為CH2C12和ch3〇h，所述CH 2C12與ch3〇h的體積 比為10-25:1，產率為70-90%。
[0018] 所述步驟(3)中，化合物S-RhB-SH為2-4當量，間苯二甲酰氯為1當量，三乙胺為2-4 當量，所述冰浴條件溫度為〇°C以下，室溫反應時間為8-15小時。
[0019]含雙碳硫鍵結構羅丹明的Hg2+熒光探針分子在檢測Hg2+中的應用。
[0020] 本發明的有益效果是:探針HgPl在CH30H-H20(9/l，v/v)體系中對Hg 2+具有高效靈 敏的專一檢測能力。通過以上紫外、熒光光譜研究等實驗結果，推測出HgPl識別Hg2+的可能 機理如附圖6所示:探針溶液中加入Hg 2+，由于Hg2+的嗜硫性，Hg2+與分子結構中' C = S'中的S 原子結合，生成并脫去兩分子的HgS，并導致羅丹明結構中的酰螺內酯環打開，釋放出熒光 信號，生成具有熒光的產物HgPl-Hg。通過HR-MS對產物HgPl-Hg的結構進行了確證(附圖7)。 實驗結果表明，HgPl-Hg理論計算值為484.2417，HR-MS結果顯示為484.2298。該數據確證了 附圖6所示作用機理。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發明的熒光探針HgPl紫外選擇性圖，插圖為溶液顏色變化圖；
[0022]圖2為本發明的熒光探針HgPl熒光選擇性圖，激發波長520nm;
[0023] 圖3為本發明的熒光探針HgPl識別Hg2+的抗金屬陽離子干擾性圖，激發波長520nm， 發射波長583nm;
[0024] 圖4為本發明的熒光探針HgPl識別Hg2+的抗陰離子干擾性圖，激發波長520nm，發射 波長583nm;
[0025] 圖5為本發明的熒光探針HgPl熒光滴定圖，插圖為最低檢測限圖，激發波長520nm;
[0026] 圖6為本發明的熒光探針HgPl識別機理圖；
[0027]圖7為本發明的熒光探針HgPl識別機理驗證高分辨圖。
【具體實施方式】
[0028]本發明中制備熒光探針HgPl的過程中所使用的化學試劑、溶劑、金屬離子等均阿 拉丁試劑公司。在熒光探針HgPl的確證和性能測試過程采用Bruke公司DTX-400型核磁共振 譜儀，溶劑為氘代氯仿，以TMS為內標記錄核磁共振氫譜和碳譜。采用Thermo公司的Q-ExactiveHR-MS質譜儀記錄高分辨質譜數據。采用日本日立公司F-7000熒光光譜儀記錄熒 光光譜。
[0029] 1、中間體RhB-SH的制備
[0030] 100mL圓底燒瓶中，將2.18g(4.5mmol)羅丹明B溶于30mL無水1，2_二氯乙烷中，冰 浴條件下滴加入1.5mL(16.4mmol)的三氯氧磷，冰浴下(0°C)反應1小時，改為85°C回流反應 3小時，減壓去除溶劑，得到羅丹明酰氯RhB-Cl;將羅丹明酰氯RhB-Cl溶于30mL無水乙腈中， 冰浴(〇°C)條件下滴加0 · 51 g(4 · 5mmo 1)半胱胺鹽酸鹽的無水乙腈溶液（15mL)，冰浴反應6小 時，使反應體系升溫至室溫，減壓除去溶劑，用乙酸乙酯（35mL)重新溶解，用純水(40mLX2) 和飽和氯化鈉溶液(40mLX2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓除去溶劑，經硅膠 柱層析分離(洗脫液為CH 2C12: CH30H=20:1，體積比）得到中間產物RhB-SH，產率為69 %。 [0031] 2、中間體S-RhB-SH的制備
[0032] 100mL圓底燒瓶中，將中間體RhB-SH( 50lmg，lmmo 1)和勞森試劑（809mg，2mmo 1)溶 于40mL無水甲苯中，加熱回流（110°C)至反應完全（15小時），減壓蒸餾濃縮除去甲苯，濃縮 物用50mLCH2Cl2溶解，飽和氯化鈉溶液(40mL X 2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮 后經硅膠柱層析分離(洗脫液為CH2C12: CH30H= 18:1，體積比）得到中間體S-RhB-SH，產率為 21%〇
[0033] 3、探針HgPl的制備
[0034] 100mL 圓底燒瓶中，將中間體 S-RhB-SH(l .29g，2.5mmol)與三乙胺（252mg， 2.5mmo 1)混合于無水二氯甲烷（40mL)溶液中，冰浴（0°C)條件下滴加入間苯二甲酰氯 (0.2g，lmmol)的無水二氯甲烷溶液（15mL)，滴加完畢后該為室溫反應，反應完全（10小時） 后，飽和氯化鈉溶液(40mLX 2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓