用于神經組織尼氏體染色的染料組合物、染液及染色方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種生物組織染色領域，具體涉及一種用于神經組織尼氏體染色的染 料組合物、染液及染色方法。
【背景技術】
[0002] 尼氏體(Nissl body)發現者是神經解剖學家Framz Nissl氏（1860~1919)，他在 1892年首次使用甲苯胺藍染出了以他本人的名字命名的小體并對結果進行觀察到尼氏小 體呈現出深藍色，它具有強嗜堿性，均勻分布。在大神經元中，如脊髓運動神經元中，呈粗大 的斑塊狀;而在小神經元里，如神經節內的神經元，呈細顆粒狀。在電鏡下，尼氏體由發達的 粗面內質網和游離核糖體構成，表明神經元具有活躍的蛋白質合成功能，主要合成更新細 胞器所需要的結構蛋白、合成神經遞質所需的酶類以及肽類的神經遞質。
[0003] 尼氏（Nissl)染色法是應用堿性染料顯示神經元的一種常規方法，廣泛應用于腦 內核團的定位、核團內神經元的類型、分布和計量學分析，它對于揭露機體神經細胞狀況的 判定具有重大參考價值。選用Pischinger氏法作標準方法，為實驗對照組對貓脊髓進行尼 氏體染色，它的基本程序為:組織切片-梯度酒精脫蠟至水-入染液lOmin-0.2M醋酸緩沖 液(PH4.6)分化1~3min-顯微鏡下觀察到尼氏體清晰為止-5%鉬酸銨液處理3~5min- 蒸餾水洗-常規脫水透明-中性樹膠封固-結果觀察-攝片、圖像與分析。它可以顯示出 神經細胞的分布情況以及對確定神經細胞的類型。同時，對研究神經細胞在生理或病理狀 態下的形態變化有一定的價值。因此，尼氏染色法已成為對中樞神經系統的顯微結構研究 中的四大主要方法之一，近一個世紀以來一直為科學家們普遍采用。其目的是為了探索和 開發具有新結構、新靶標的染色劑。
[0004] 因此，要完美與清晰的顯示出神經組織中尼氏體的染色除選擇優良的試劑以外， 還要不斷的創新，改變染料分子的性質，才能獲得更好的染色效果，才有利于更好的為醫學 教學與科學研究服務，同時也為研發神經系統新型染色技術提供了重要的線索和理論依 據。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此，本發明提供一種用于神經組織尼氏體染色的染料組合物、染液及染色 方法，經其染色后的動物神經組織切片的分辨率、美觀度和清晰度幾個方面均比傳統的 Pischinger氏染色方法以及其它幾種單種染色液染色方法的效果更好。
[0006] 為解決以上技術問題，本發明提供的第一方面的技術方案是采用一種用于神經組 織尼氏體染色的染料組合物，所述染料組合物由以下組分按重量份組成：1.〇重量份美藍和 0.8-1.0重量份硫堇;所述美藍的分子結構式如下：
[0008] 所述硫堇的分子結構式如下：
[0009] 優選的，所述染料組合物由以下組分按重量份組成：1.0重量份美藍和1.0重量份 硫堇。
[0010] 另外，本發明提供的第二方面的技術方案為前述任一所述的染料組合物形成的神 經細胞尼氏體染液，所述染液由美藍、硫堇、氯化鈉以及70 % -80 %的乙醇溶液組成，乙醇溶 液作為溶劑：
[0011] (1)質量百分比為1 %或〇. 8 % -1 %的硫堇乙醇染色液；
[0012] (2)質量百分比為1%的美藍乙醇染色液；
[0013] ⑶按硫堇乙醇染色液:美藍乙醇染色液:0.9%氯化鈉溶液的體積比為1:1:9進行 配制成神經組織尼氏體染液。
[0014] 另外，本發明提供的第三方面的技術方案為一種用于神經組織尼氏體染色的染料 組合物，所述染料組合物由以下組分按重量份組成：1.〇重量份美藍、0.8-1.0重量份硫堇、 0. 1-0. 2重量份天青A和0. 1-0. 2重量份天青B;所述天青A的分子結構式如下：
[0015] 所述天青B的分子結構式如下
[0016] 優選的，所述染料組合物由以下組分按重量份組成：1.0重量份美藍、1.0重量份硫 堇、0.1-0.2重量份天青A和0.1-0.2重量份天青B。
[0017] 另外，本發明提供的第四方面的技術方案為前述任一所述的染料組合物形成的神 經組織尼氏體染液，所述染液由美藍、硫堇、氯化鈉以及70%_80%的乙醇溶液組成，乙醇溶 液作為溶劑：
[0018] (1)質量百分比為1 %或0.8 % -1 %的硫堇乙醇染色液；
[0019] (2)質量百分比為1%的美藍乙醇染色液；
[0020] (3)質量百分比為0.1-0.2 %的天青A乙醇染色液；
[0021 ] (4)質量百分比為0.1-0.2%的天青B乙醇染色液；
[0022] (5)按硫堇乙醇染色液：美藍乙醇染色液：天青A乙醇染色液：天青B乙醇染色液： 0.9%氯化鈉溶液的體積比為1:1:1:1:9進行配制成神經細胞尼氏體染液。
[0023] 另外，本發明提供的第五方面的技術方案為一種對神經組織尼氏體染色的染色方 法，所述染色方法包括以下步驟：
[0024] 1)動物組織用固定液固定20-24小時后干燥；
[0025] 2)放入權3或權6任一所述的染液進行染色7-14天；
[0026] 3)固定處理20-24小時；
[0027] 4)乙醇分色與脫水、石蠟包埋切片。
[0028]優選的，所述步驟1)中動物組織為整塊的動物神經組織。
[0029] 11、優選的，所述步驟1)中固定液由以下成分組成:冰醋酸、40 %甲醛溶液、70 %酒 精液按體積比為1:3:16。
[0030] 優選的，所述步驟1)中干燥的方式為固定液固定所得動物組織經自然干燥后，再 放入1 %火棉膠液中處理，再次自然干燥。
[0031] 優選的，所述步驟3)中固定處理為將步驟2)所得染色后動物組織放入5%的鉬酸 銨水溶液中固定處理20-24小時。
[0032] 優選的，所述步驟4)中所述乙醇為95%-100%乙醇溶液。
[0033] 本申請所述用于神經組織尼氏體染色的染料組合物的基本說明如下：
[0034] 本發明人通過長時間的研制得出，本申請所述的染料組合物可以有效的對生物組 織進行染色，經其染色后的動物神經組織切片的分辨率、美觀度和清晰度幾個方面均比傳 統的Pischinger氏染色方法以及其它幾種單種染色液染色方法的效果更好。
【附圖說明】
[0035]圖1是經1組硫堇染液染色之后對應貓脊髓的顯微鏡下觀察得到的組織切片效果 顯示圖；
[0036] 圖2是經2組美藍染液染色之后對應貓脊髓的顯微鏡下觀察得到的組織切片效果 顯示圖；
[0037] 圖3是經3組本發明所述染液染色之后對應貓脊髓的顯微鏡下觀察得到的組織切 片效果顯示圖；
[0038] 圖4是1-4組染液染色14天后的貓脊髓組織切片的尼氏體平均灰度值。
【具體實施方式】
[0039] 為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對 本發明作進一步的詳細說明。
[0040] 下面將列舉一些與本申請相關的用于動物神經組織尼氏體染色的染液及其實施 步驟。
[0041] 實驗步驟:實驗動物組織樣品制備與分組
[0042] 選用健康成年家貓5只，體重1.5~2.0kg，用2%的戊巴比妥鈉（40mg/kg)腹腔麻 醉，固定采用自左心室通過靜脈套管快速灌注生理鹽水沖洗，待流出清亮液體后，灌注10 % 中性甲醛固定30分鐘，暴露脊髓頸、腰膨大，取其橫切長為0.4~0.5cm的組織24塊，放入固 定液中固定20~24小時，其中固定液是由體積比為1:3:16的冰醋酸、40 %甲醛溶液、70 %酒 精液組成。再將所取組織隨機分成兩組，對照組和實驗組，3塊用于對照組，21塊用于實驗 組。對照組用Pischinger氏美藍液染色(4組），實驗組采用美藍染液(美藍質量百分比濃度 為1 %的乙醇溶液，1組）、硫堇染液(硫堇質量百分比濃度為1 %的乙醇溶液，2組）以及本發 明所述染液(3組)進行染色，實驗組每種染液染色的組織各7塊。分別經染色7天、10天、14天 后，取出放95%的酒精30min，100%的酒精各lh，二甲苯15min，入軟蠟2h，入硬蠟2h，硬蠟包 埋，烘干24~48小時，切片厚5um;展片后，經二甲苯脫蠟，中性樹膠封片;結果經顯微鏡觀察 與分析。
[0043]尼氏體判斷的意義
[0044]尼氏體是神經細胞中所特有的結構，它是位于胞體和樹突(軸丘和軸突除外）內的 嗜堿性物質，呈大小不等的塊狀或顆粒狀;它的主要化學成分是核糖核酸和蛋白質，常稱為 核蛋白體，是蛋白質合成場所；它的形態與大小，在不同的神經元內表現不同，當神經細胞 受到損傷時，尼氏體會顯著減少甚至消失;它的形態、大小在各種不同的染色液中和不同的 生理機能狀態下的同一種神經細胞都有所不同，這反映了染色液對粗面內質網的著色程度 有變化，例如細胞體未壞死，則溶解的尼氏體可以重現，胞體代謝也可逐漸恢復，它的數量 和分布的改變可以作為判斷神經細胞病變程度或藥物治療療效的良好指標。
[0045]細胞形態特征的染色的結果
[0046]經1~4組染液染色對應的組織樣品所對應神經細胞的染色的結果，在顯微鏡下觀 察切片的染色效果和尼氏體以及細胞形態的保存情況并分別作了比較，在1、2和4組可觀察 到在組織染色效果和尼氏體以及細胞形態的保持都無較大區別，而在3組對尼氏體以及細 胞形態染色與保持方面的合格指數值更高，即尼氏體著色呈紫蘭色，細胞核與細胞質染色 更鮮艷。經過1~4組染液染色以后相對應的組織樣品以及它們的神經細胞所對應的染色結 果(見表1)。
[0047] 表1在1~4組染液染色對應的組織樣品所對應神經細胞的染色質量指數表
[0048]
[0049] 上述實驗中經1組硫堇染液染色、2組美藍染液染色、3組本發明所述染液染色之 后，對應貓脊髓的顯微鏡下觀察得到的組織切片效果顯示圖，可參見附圖1~3所示。
[0050] 圖像分析
[0051] 應用平均灰度質對尼氏體進行定量方面的研究與分析，由于尼氏體數量的多少在 圖像分析中用平均灰度和面積（％)來表示。而經尼氏染色獲得的數據處理需借助于圖像處 理技術，其中，平均灰度在圖像分布中表示圖像的透光率，分為256級，最暗為0級，最亮為 256級。其中尼氏體平均灰度質越低，說明了染色越深，即細胞內尼氏體含量就越高。為此， 可知尼氏體的平均灰度值與細胞內尼氏體含量的關系，即平均灰度質越低，其細胞內尼氏 體含量越高，也可見平均灰度質和尼氏體染色深度成反比；在圖像上灰度的深淺也反映了 各部分尼氏體顏色的深淺程度以及含量的多少，若染色獲得的切片標本顏色越淺，卻灰度 的值反而出現越高的現象。
[0052] 數據處理
[0053] 所有測定值以平均值上標準差表示。統計學意義通過Microsoft Excel5 .Ofor widows電子表格軟件中的F檢驗和t檢驗進行評價，P值〈0.05為具有顯著性差異。應用 Luzed-F型圖像分析系統，對脊髓染色的切片在20倍物鏡下隨機抽樣測定30