作為生物標記物的電中性金屬配合物的制作方法

作為生物標記物的電中性金屬配合物的制作方法
【專利說明】作為生物標記物的電中性金屬配合物
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年6月18日提交的題目為"作為生物標記物的電中性金屬配合物" 美國臨時申請No. 61 /956，810的權益，將該申請的內容并入本文作為參考。 發明領域
[0003] 本發明涉及可生物偶聯的發光金屬配合物，以及它們作為新型標記分子在化學、 生物化學和生物分析領域中的應用，如免疫檢測和DNA探針。更具體的說，本發明涉及電中 性的電化學發光標記分子以及它們在電化學發光免疫分析中的應用。
[0004] 發明背景
[0005] 基于生物親和性（即兩種生物活性物質，如抗體/抗原，的選擇性結合)的生物分析 方法在很大程度上依賴生物標記分子，標記技術以及對產生于標記分子的信號的檢測。生 物標記分子是能夠自身，或者在與其它試劑發生物理/化學相互作用時，發出能與被測物質 的量相關的可檢測的信號的化學或生物化學物質。生物標記分子包括，但不僅限于:含放射 性原子的分子(放射性），發光化合物(在光激發或化學反應中發光），電活性化合物(通過氧 化還原反應產生電信號），磁性顆粒(磁信號）和酶(通過與底物的反應，生成可檢測的物質 或者光信號）。生物標記分子包含一個或多個信號產生單元以及一個或多個反應性基團。后 者與待標記的生物分子易于形成共價鍵。標記過程是將一個或多個標記分子和生物活性物 質結合形成復合物，該復合物保持對特定待檢測物質的生物親和性。
[0006] 通過一系列的電化學氧化還原反應以及與共反應劑（諸如專利US 6451225和US 6702986中披露的三丙胺)發生的后續化學反應，電化學發光(ECL)已經發展成為一種成熟 的生物分析技術，在此技術中，一種金屬配位化合物，如舒（Π )多二亞胺(polydiimine)復 合物，被用作ECL標記分子的信號產生單元。美國專利（5221605,5238808,5310687， 5714089,5731147,6140138,6316607)和許多研究論文披露了ECL標記分子以及它們在免疫 分析和 DNA 探針領域的應用 Η^Ι^η:6·Ρ·Β1α^Λι?Γηθ?Β?·，(：Ηη·αιθπκ1991，37/9，1534-1539;J.H.Kenten et al.，Clin.Chem.l991,37/9,1626-1632·)。
[0007] 對ECL標記分子的改進是一個長期持續的努力方向。一方面，有大量的工作試圖通 過在一個或多個與釕（II)離子配位的配體上連接上功能基團而重新設計釕（II)配合物。另 一方面，把ECL發光體從釕（II)配合物擴展到其它金屬配合物的努力也進行了很多，其中一 些在專利中有所披露。比如美國專利5858676和6468741分別公開了稀土金屬配合物和錸配 合物的 ECL。專利申請 W02012107420，US2013/0323719，US2013/0323857，W02014019707， W02014019708和W02014019711則公開了用作ECL標記分子的基于銥的新型配合物。
[0008] 在基于釕（II)的ECL發光體的改進方面，美國專利US 5981286公開了帶有親水性 雙齒配體的釕（II)配合物。W0 99/15694公開了一種分子設計，其中金屬配合物發光體通過 共價鍵與共反應劑（即三丙胺或其類似物)相連接。不過，由于在ECL過程中，共反應劑是要 被消耗的（而不是循環使用），所以它的濃度在實際的生物測定中須比發光體的濃度高很多 倍。這種方案不能幫助提高ECL的強度。為了提高ECL生物檢測的靈敏度，美國專利US 5679519公開了一種多標記的探針復合物，它包含有生物素化的牛血清白蛋白分子作為平 臺，以及大量被該平臺結合的電化學發光標記分子。另外，美國專利申請US 2005/0059834 中也提出了構造擔載有多個ECL發光體的樹枝狀構架從而實現在生物分子的單個位點上進 行多標記（也見M.Zhou et al.，Anal.Chem.2003,75,6708-6717)。
[0009] 進一步地，雙齒配體的的選擇也已經超越了以2，2 聯吡啶和1，10-菲咯啉的基礎 類型。美國專利7750157 B2(EP1759204 A1)公開了一種釕（II)標記物設計，其中生物偶聯 臂連接在一個既非2，2 聯吡啶也非1，10-菲咯啉的雙齒配體上。
[0010] 以上專利和研究論文中所披露的這些釕（II)ECL發光體（沒有生物偶聯基團）和 ECL標記分子(帶有生物偶聯基團）的一個共同特點是它們都有一個帶正電荷的金屬配合物 發光體(見圖1A)，和不發光的反離子，如氯離子Cr或六氟磷酸根離子PFf等。用這些發光體 標記的物質的生物活性或者選擇性親和能力會由于帶正電的金屬配合物的引入而降低。降 低了的生物活性在基于生物親和性的生物檢測中會提升非特異性結合，從而降低生物分析 的靈敏度和重復性。針對帶有正電性ECL發光體的標記物的這一缺點，美國專利5958783 (CN1134154，EP0720614 B1)公開了一類ECL標記分子(見圖1B)，其特征在于，在帶正電的發 光體和反應基團（即生物偶聯基團）之間有一個帶電荷的連接體。據其披露，由于降低了對 蛋白的非特異性結合，這類標記物改進了ECL免疫分析的性能。不過在這個標記物中，信號 產生單元(ECL發光體)本身還是帶正電荷的金屬配合物，需要反離子來中和其正電荷。
[0011] 同樣為了降低有害的非特異性結合，美國專利6808939B2(CN1612861A)公開了一 類帶電荷(尤其是負電荷)功能基團的雙齒配體（即聯吡啶和菲咯啉）以及含有這些帶電荷 配體的釕（II)配合物標記分子(見圖1C)。這些結構為M(L'）（L"） 2的二雜配標記分子具有負 電荷以及可離解的陽離子。結果顯示，一些帶負電荷的發光體標記在抗體上后，非特異性的 ECL信號顯著降低。然而，在降低非特異性信號的同時，沒有顯示對特異性信號水平的改進。
[0012] 這些ECL發光體或含這些發光體的標記分子或者帶正電荷（絕大多數情況），或者 帶負電荷，都需要有反離子來中和電荷。它們都是離子性化合物，在電解液溶液中均會分開 或電離成陽離子和陰離子。此外，已經合成的這些金屬配合物或者是二雜配，或者是均配金 屬配合物，即配合物中至少有兩個二齒配體是相同的。
[0013] L.Della Ciana等（J.Phys.Chem.C 2010,114,3653-3658)描述了一個二雜配兩性 離子釕(II)發光體，其含有兩個相同的2,2'_聯吡啶配體和一個苯磺酸化的菲咯啉配體，該 發光體在水相中的ECL強度與三聯吡啶釕（II)配合物相比要高。不過，和其它一些不具有生 物偶聯基團的、報道所稱的高強度ECL發光體一樣，該發光體用于ECL免疫分析不可行，而且 在該金屬配合物上引入反應性生物偶聯基團的合成方法也未建立。
[0014] 釕(II)配合物在包含有共反應劑和溶劑的特定電解質溶液中的ECL強度隨著配體 的結構和配體的組合方式不同而差別巨大。由于ECL產生過程的復雜性(W.Miao et al， JACS，2002，124，14478-14485)，一般共識是，任何單一的性質，諸如光量子效率，氧化還原 電勢，發光波長以及發光體的電荷狀態與ECL強度沒有相關性（M.Zhou et al， Inorg. Chem. 2005，44，8317-8325)。不過，用電中性的發光體標記一個生物物質不會改變該 物質的電荷狀態。因此，在大小相近或分子量類似的標記物中，電中性的標記分子對于待標 記生物物質的生物活性的影響最小。鑒于此，本發明注重設計配體的結合方式，以使金屬配 合物(例如釕（II)配合物)成為電中性的ECL標記物，其在水性緩沖溶液或任何其它溶劑中 不解離成陽離子和陰離子。
[0015] 在我們通過使用電中性標記物降低標記物對被標記物活性的影響的同時，我們驚 奇地發現電中性的ECL標記物不僅降低了非特異性信號，一部分電中性ECL標記分子還產生 了更高的ECL強度。
[0016] 過去公開的釕（II)配合物標記分子的合成主要遵循一種方法(見下面反應式）。在 這種方法中，首先合成順式I了二亞胺二氯化物(cis-ruthenium diimine(L)dicholoride)， 即cis-RU(L)2Cl 2)，然后再將具有生物偶聯功能的二亞胺配體與金屬離子配位。
[0017] RuCl3\xH2〇+L-cis-Ru(L)2Cl2(l)
[0018] cis-Ru(L)2Cl2+L'-Ru(L)2(L'）C12(2)
[0019] 美國專利US 6808929B2公開了另一種合成方法(專利中的實施例2)。其中，一個具 有生物偶聯功能的二亞胺配體，即4-甲基-4'-(3-羧丙基)-2,2'_聯吡啶，先和氯化釕（II) 發生配位，而后再引入另外兩個相同的配體，形成ECL標記物。
[0020] 這些合成方法產生二雜配配合物標記分子，它們具有兩個不具有生物偶聯功能的 相同配體和一個具有生物偶聯功能的配體。合成三雜配金屬配合物ECL標記分子的工作在 現有技術中還未見報道。
[0021] 不同于圖1A-C中那些具有帶正電荷或者帶負電荷的釕（II)發光體，圖1D所示的電 中性ECL標記分子具有三個不同的配體，不能套用二雜配配合物標記分子的合成方法來進 行合成。所以，本發明中除了披露配體組合模式外，該發明也涉及一種將三個不同的二亞胺 配體依次與金屬離子配位形成三雜配ECL標記分子的合成方法。
[0022]本發明進一步公開了用這類中性ECL發光體標記的生物物質以及它們在ECL免疫 分析中的應用。
[0023] 本發明的一個目的是提供具有電中性金屬配合物發光體的發光生物標記物。
[0024] 本發明的另一個目的是提供導致金屬配合物發光體呈電中性的不同的配體組合 模式。
[0025] 本發明的又一個目的是提供具有電中性金屬配合物發光體的三雜配標記物的合 成方法。
[0026] 本發明的再一個目的是提供標記有電中性金屬配合物發光體的物質。
[0027] 本發明還有一個目的是提供用于開展化學物質、生物化學物質和生物活性物質的 ECL定量分析的生物標記分子。
[0028] 發明概述
[0029]本發明涉及生物分析方法的改進，具體來說是利用金屬配合物的電產生化學發光 或電化學發光(ECL)的免疫分析和核酸檢測。本發明所描述的金屬配合物以釕（II)配合物 作為實例。但是，能生成與金屬釕(II)多二亞胺配合物類似的金屬螯合物的其它過渡金屬， 如金屬鋨、鉑、錸、銥等，也在本發明的涵蓋范圍內。
【附圖說明】
[0030]圖1展不現有技術公開的(A-C)和本發明披露的(D)ECL標記分子。
[0031] 圖2是化合物3的1H NMR圖譜。
[0032] 圖3是化合物6的1H NMR圖譜。
[0033] 圖4是化合物10的1H NMR圖譜。
[0034] 圖5是化合物15的1H NMR圖譜。
[0035] 圖6是化合物16的1H NMR圖譜。
[0036] 圖7是標記分子17的1H NMR圖譜（圖譜左邊:芳香環區；圖譜右邊:脂肪鏈區）。
[0037] 圖8是標記分子18的1H NMR圖譜。
[0038] 圖9是標記分子19的1H NMR圖譜。
[0039] 圖10是標記分子20的1H NMR圖譜。
[0040] 圖11是標記分子16，19,27和Ru(2,2'_聯吡啶)2[4-(2,2'_聯吡啶-4-基)丁酸]Cl 2 (標識為Ru-Ref)的吸收光譜。
[0041 ] 圖12是標記分子16，19,27和Ru(2,2'_聯吡啶)2[4-(2,2'_聯吡啶-4-基)丁酸]Cl 2 (標識為Ru-Ref)的光致發光光譜。
[0042]圖13比較不同標記分子在含有三丙胺的pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液中以1.4V vs.Ag/AgCl階躍電勢激發所得到的電化學發光強度。釕（II)配合物的濃度均為:0.1μπι〇1 L-、
[0043] 圖14比較標記分子16和Ru-Ref在含有三丙胺的pH值為6.8的磷酸緩沖溶液中以 1.4V vs.Ag/AgCl電階躍電勢激發所得到的電化學發光強度。釕(II)配合物的濃度分別為： 10-7，10- 8，10-9mol L-、
[0044] 圖15比較使用標記分子16和Ru-Ref在免疫分析測試中的ECL信號強度。
[0045] 發明詳述
[0046] 本文中所用到的術語"金屬配合物"，"配位金屬配合物"，"發光金屬配合物"，"ECL 金屬配合物"，"釕（II)配合物"，"金屬釕（II)配合物"和"金屬螯合物"有時可交替使用。在 本發明的范圍里，金屬配合物或者ECL金屬配合物包含"發光體"或"ECL發光體"以及"標記 分子"或"ECL標記分子"。前者是沒有生物偶聯基團的金屬配合物，而后者則指的是具有生 物偶聯基團的金屬配合物。生物偶聯基團是一類功能化的或能進行反應的反應性基團，它 可以在溫和的條件下，如處于室溫的生理緩沖溶液中，和其它化學、生物化學和生物物質發 生反應，形成高度穩定的共價鍵。
[0047] 在本發明的范圍內，被稱作"標記物"，"標記物分子"，"釕(II)標記物"和"ECL標記 物"的物質可與其它物質形成共價鍵，這些其它物質諸如，具有生物活性的被測物或其類似 物，基于親和性的被測物的識別性配對物或