基于光點擊反應且具有熒光響應的dna標記物及制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于核酸標記領域，特別設及一種基于光點擊反應且具有巧光響應的DNA 標記物及制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 核酸是一類由核巧酸單體聚合而成的生物大分子，是生物細胞最基本和最重要的 成分。目前，核酸修飾技術是醫學和生物學領域中的常用研究工具，且已經被廣泛地用，核 酸分子的修飾在分子識別的基礎研究、生物醫學診斷和DNA納米結構構建起重要作用。
[0003] 早期傳統的DNA修飾方法是直接在DNA上修飾巧光分子，此方法對技術和設備要 求較高操作復雜，純化手段復雜，不利于大規模推廣。近些年生物正交反應備受關注，尤其 是應用于核酸和蛋白質的修飾。生物正交反應具有操作簡單，反應物易于合成、特異性高等 優點，其在分子識別和醫學診斷領域應用廣泛。
[0004] 近期基于點擊化學的生物正交反應備受關注，尤其是利用點擊反應對蛋白和核酸 的修飾。點擊化學是一種疊氮化合物和烘控的環化加成反應，它是2001年，由諾貝爾化學 獎獲得者化a巧less報道出來的。它有反應速度快、反應條件較溫和、產率高、副產物少和 立體選擇性高等特點，因此該方法自提出W來在化學、生物醫藥、分子識別、高分子合成等 領域都有廣泛應用。
[0005] 目前常用的基于點擊化學反應的DNA標記方法有：銅離子催化的疊氮化合物和烘 控的環化加成反應（CuAAC)，此方法微量的銅離子就能催化該反應的發生，反應速度快，但 是有報道過渡態金屬催化劑銅（I)可W誘導病毒或寡核巧酸的降解，并且銅（I)作為催化 劑具有細胞毒素，因此不適合在生物體內的應用。此外還有非銅催化的疊氮化合物和烘控 的環化加成反應，此反應速度慢，反應時間長，降低了該方法的推廣及普及性。
[0006] 近幾年基于光點擊的生物正交反應被廣泛報道，如基于光點擊反應實現對蛋白質 的修飾，是一種光控的且有巧光響應的蛋白質修飾方法。該方法是具有實時光控的生物正 交反應，具有光誘導實時可控，非金屬催化，無毒，反應速度快，產率高、操作方便簡單，應用 性廣等優點。
[0007] 有文獻報道了一種基于光點擊反應的DNA修飾方法，該方法首次將光點擊反應應 用于核酸修飾中，利用L邸燈就可W實現核酸的標記，操作方便簡單，反應速度快等優點。 但是該方法只實現了DNA的修飾，反應后沒有巧光響應，不具備多方面的應用。因此開發一 種基于光點擊反應且具有巧光響應的DNA標記物在實際應用中仍具有重要意義。
【發明內容】
[0008] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種基于光點擊反 應且具有巧光響應的DNA標記物，該標記物具有實時光控的，具有光誘導實時可控、具有巧 光響應、應用性廣等優點。
[0009] 本發明的另一目的在于提供上DM標記物的制備方法。
[0010] 本發明的再一目的在于提供上述DNA標記物的應用。
[0011] 本發明的目的通過下述技術方案實現： 陽01引一種基于光點擊反應且具有巧光響應的DNA標記物，為化合物W-3和W-4中的至 少一種；所述的W-3和W-4結構式如式I和II所示：
[0013]
[0014] 所述的基于光點擊反應且具有巧光響應的DNA標記物的制備方法，包括如下步 驟：
[0015] (1)將四挫化合物W-I(Methyl4-(2-(4-methy；L-2-〇x〇-2H-cbomen-7-;yl)-2H-te trazo^5-yl)benzoate)與氨氧化裡在四氨巧喃甲醇和水的混合液中加熱攬拌反應，反應 終止后調節溶液的抑值至出現紫色沉淀；得到中間體W-2 ;
[0016] 似將步驟（1)制得的W-2與畑S(N-^基下二酷亞胺）、邸C(l-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）在DMF(N，N-二甲基甲酯胺）中攬拌反應W活化W-2 ;反應 終止后，加入飽和食鹽水至沉淀析出，得到化合物W-3,即為具有巧光響應的DNA標記物基 于光點擊反應且具有巧光響應的DNA標記物；
[0017] 做將乙胺加入二氯甲燒中，然后再加入步驟似制得的W-3攬拌反應，減壓蒸饋， 得到W-4 ; 陽01引步驟（1)中所述的W-I與氨氧化裡的摩爾比優選為1: (15~20);
[0019] 步驟（1)中所述的W-I與氨氧化裡的摩爾比進一步優選為1:20 ;
[0020] 步驟（1)中所述的甲醇、四氨巧喃和水的混合液中，甲醇、四氨巧喃和水的體積比 優選為1 : (2~3) : 1 ;
[0021] 步驟（1)中所述的甲醇、四氨巧喃和水的混合液中，甲醇、四氨巧喃和水的體積比 進一步優選為1:2:1 ;
[0022] 步驟（1)中所述的加熱攬拌反應的溫度優選為45°C~55°C;
[0023] 步驟（1)中所述的加熱攬拌反應的溫度進一步優選為50°C;
[0024] 步驟（1)中所述的加熱攬拌反應的時間優選為12~14h;
[0025] 步驟（1)中所述的加熱攬拌反應的時間進一步優選為12h;
[0026] 步驟（1)中所述的抑值優選為2~4. 5,更優選為3 ;
[0027] 步驟似中所述的W-2與N服和邸C的摩爾比優選為1:2:2 ;
[002引步驟似中所述的攬拌反應的時間優選為12~14h;
[0029] 步驟似中所述的攬拌反應的時間優選為12h;
[0030] 步驟（3)中所述的乙胺與W-3的摩爾比優選為2:1 ; 陽03U步驟（3)中所述的攬拌反應的時間優選為0. 5~化；
[0032] 所述的四挫化合物W-I的結構式如式III所示：
[0033]
Ain;
[0034] 所述的中間體W-2的結構式如式IV所示：
[0035]
或
[0036] 所述的基于光點擊反應且具有巧光響應的DNA標記物在核酸標記領域中的應用；
[0037] 所述的基于光點擊反應且具有巧光響應的DNA標記物在核酸標記領域中的應用， 包含如下步驟：
[0038] (1)將基于光點擊反應且具有巧光響應的DNA標記物與具有氨基的核酸序列在棚 酸鋼緩沖液中避光解育進行縮合反應，用預冷的無水乙醇將核酸沉降出來，得到DNA標記 物標記的核酸（核酸探針等）；
[0039] 似將步驟（1)中制得的DNA標記物標記的核酸與二甲胺基丙基丙締酷胺在紫外 光下發生光點擊反應，得到具有巧光響應的核酸；
[0040] 步驟（1)中所述的核酸序列優選為5'端氨基標記或3'端氨基標記；
[0041] 步驟（1)中所述的棚酸鋼緩沖液的抑優選為7. 5~8. 5,進一步優選為8.0;
[00創步驟（1)中所述的縮合反應的時間優選為12~16小時，進一步優選為14小時；
[0043] 步驟（2)中所述的核酸探針與二甲胺基丙基丙締酷胺的優選摩爾比是1 : (20~ 50)更優選為1:40 ;
[0044] 步驟（2)中所述的紫外光的波長優選為302nm; W45] 步驟似中所述的紫外光照射時間優選是2min;
[0046] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
[0047] (1)反應過程中生成巧光基團，有巧光響應。反應完后不需要清洗步驟即可。
[0048] 似反應由光誘導，可控。 W例 做反應速度快，產率高，副產物少。
[0050] (4)反應條件簡單溫和，反應過程中氧氣和水對反應無影響。
[0051] (5)反應原料容易獲得，反應產物合成簡單（圖I)。
[0052] (6)操作簡單，易于普及。
【附圖說明】 陽05引圖1是本發明的DNA標記物W-3的制備合成路線圖。
[0054] 圖2是實施例1得到的DNA標記物W-3的核磁共振氨譜圖。 陽化引圖3是實施例1得到的DNA標記物W-3的ESI質譜圖。
[0056] 圖4是實施例2中的W-4與四種不同締控化合物點擊之后的巧光光譜圖。
[0057] 圖5是實施例3中得到的標記四挫化合物W-3的探針的質譜圖。
[0058] 圖6是實施例4中標記后的探針點擊之后在不同抑值的緩沖液中的巧光光譜圖。
[0059] 圖7是實施例5中得到的核酸探針光點擊前后巧光強度的變化結果分析，其中，A: 巧光光譜結果分析；B:聚丙締酷胺凝膠電泳結果分析；C:紫外吸收結果分析；D:點擊反應 后的質譜結果分析。
[0060] 圖8是實施例6中在不同紫外光照射下光點擊反應速率圖。
【具體實施方式】
[0061] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0062] 實施例中所述的四挫化合物W-1 (Methyl4- (2- (4-methy]_-2-〇x〇-2H-c虹omen-7-yl)-2H-tetrazol-5-yl)benzoate)根據參考文獻狂hipeng化，LokYinHo,Zhiyong Wang,QingLin,Z.化etal.Bioorg.Med.Qiem.Lett. 21 (2011) 5033 - 5036)合成；
[0063] 所述的四挫化合物W-I的結構式如式III所示：
[0064]
式m; 陽0化]所設及的化學試劑均由阿拉下購買，所設及的DNA產品均由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成；
[0066] 所述的巧光光譜儀化S55)購自巧金埃爾默儀器（上海）有限公司； 陽067] 實施例1 一種基于光點擊反應且具有巧光響應的DNA標記物的制備W側 （1)將四挫化合物W-l(362mg，1.0mm〇U溶于6ml四氨巧喃，然后加入3ml甲醇，得 到混合液；將氨氧化裡（840mg，20.Ommol)溶于3ml水，得到氨氧化裡溶液；然后將氨氧化 裡溶液滴入混合液中，50°C攬拌過夜（1化），化C跟蹤檢測反應；反應完全后，用Imol/L的碳 酸氨鋼和Imol/L的鹽酸調節反應液的抑值在調節抑值的過程中有紫色沉淀析出，把反應 液的抑值調節到3. 0至沉淀完全析出；過濾將沉淀收集，并用大量的水反復沖