用于測(cè)定超氧陰離子和多硫化氫的熒光團(tuán)衍生物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于聯(lián)動(dòng)檢測(cè)超氧陰離子的2'）和多硫化氨的巧光探針，具體的說是 一種用于測(cè)定超氧陰離子和多硫化氨的巧光團(tuán)衍生物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 硫化氨是近年來研究較多的一種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，它對(duì)生命體中屯、腦血管系 統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)都起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。而有研究發(fā)現(xiàn)，硫化氨實(shí)際上是多硫化氨在細(xì) 胞中作用的釋放物，在細(xì)胞中實(shí)際起作用的是多硫化氨，在細(xì)胞的損傷和氧化應(yīng)激中能起 到抗氧化劑的作用。多硫化氨、W及其他的多硫化物能夠產(chǎn)生一系列的生理反應(yīng)來維 持細(xì)胞的健康。我們還發(fā)現(xiàn)，多硫化氨的產(chǎn)生依賴于化'對(duì)細(xì)胞的刺激，細(xì)胞中的〇2'主 要來源于線粒體。產(chǎn)生多硫化氨的細(xì)胞器實(shí)際上是線粒體。一定量的化?會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生 氧化應(yīng)激，在脫硫酸-丫-裂解酶（CS巧和脫硫酸-P-合成酶（CB巧的作用下產(chǎn)生多硫化 氨。但是目前發(fā)表的檢測(cè)〇2'和多硫化氨的探針都是單獨(dú)檢測(cè)，而細(xì)胞中的氧化還原過程 是十分復(fù)雜的，是由很多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果，為了更好地研究〇2'和多硫化氨之間的 互相作用，設(shè)計(jì)一種巧光探針同時(shí)檢測(cè)活性氧和多硫化氨具有十分重要的意義。在未來研 究中，區(qū)分細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能是&S誘導(dǎo)的效應(yīng)，還是多硫化氨介導(dǎo)的效果將是重要的努力 方向。因此，細(xì)胞線粒體內(nèi)的多硫化氨在多大程度上W及通過什么機(jī)制受〇2'調(diào)控、并開啟 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍有待進(jìn)一步明確。運(yùn)就需要新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明：在多硫化氨信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程 中，多硫化氨分子是否為實(shí)際的信號(hào)傳導(dǎo)分子。如果該情況得到證實(shí)，那么&S可能只是基 于多硫化氨信號(hào)傳導(dǎo)終端所釋放的終產(chǎn)物，即作為多硫化氨的還原產(chǎn)物。運(yùn)也與生理狀態(tài) 的&S濃度總是保持在較低的濃度（nM)相一致。本專利中所設(shè)及的巧光探針將有助于探索 &S可能不是實(shí)際的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，許多生理效應(yīng)是基于多硫化氨介導(dǎo)和調(diào)控的結(jié)果， W期解決運(yùn)個(gè)關(guān)鍵的問題。
[0003] 鑒于〇2'調(diào)控多硫化氨細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要生物醫(yī)學(xué)意義，發(fā)展用于檢測(cè) 〇2'和多硫化氨濃度變化水平的分析方法已經(jīng)變得越來越迫切。目前，用于檢測(cè)〇2'的方 法有：電子順磁共振法，SOD酶活性測(cè)定法，高效液相色譜法她LC)W及電化學(xué)方法；用于 檢測(cè)多硫化氨的方法有：比色法，電化學(xué)分析，色譜分析法。但是運(yùn)些方法往往需要試樣預(yù) 處理，巧光探針方法W其高時(shí)空分辨、操作簡(jiǎn)便和原位非損傷檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在生物活性物種 檢測(cè)領(lǐng)域，已成為一種功能強(qiáng)大的研究輔助工具。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于測(cè)定超氧陰離子和多硫化氨的巧光團(tuán)衍生物及 其應(yīng)用。 陽〇化]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] 一種用于測(cè)定超氧陰離子和多硫化氨的巧光團(tuán)衍生物，巧光團(tuán)衍生物如通式I所 示，
[0007]
[0008] 通式I中：
[0009] Ri為C1 22烷基、面代芐基或Ci-Ci2有機(jī)酸醋鏈；
[0010] R2為氨、橫酸基、氨基、簇基、硝基或面素；
[0011] X(定位功能基團(tuán)）為氨、下基S苯基鱗基團(tuán)、N-丙基嗎嘟基、生物素基、葉酸基、糖 基鏈基、芐基氯或。22烷基； 陽01引Yi為N、0或S; 陽01引Yz為N、0或S。
[0014] 一種用于測(cè)定超氧陰離子和多硫化氨的巧光團(tuán)衍生物的應(yīng)用，W所述通式I所示 的巧光團(tuán)衍生物作為化'或多硫化氨的聯(lián)動(dòng)檢測(cè)巧光探針。
[0015] 一種巧光探針：巧光探針為通式I所示的巧光團(tuán)衍生物，其W花菁等染料作為巧 光母體，并在母體引入親脂性對(duì)具備線粒體、癌細(xì)胞定位功能團(tuán)-0H、下基S苯基鱗基團(tuán)、 N-丙基嗎嘟基團(tuán)、生物素基、葉酸基、糖基鏈基、芐基氯或。22烷基；W及在母體Y2處所引 入鄰、間、對(duì)硝基苯基。
[0016] 所述母體Y2處所引入鄰、間、對(duì)硝基苯基，與Y2共同形成檢測(cè)基團(tuán)。
[0017] 所述巧光探針用于定性/定量的聯(lián)動(dòng)檢測(cè)生理環(huán)境下細(xì)胞或生物體內(nèi)外的化'或 多硫化氨濃度。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 本發(fā)明化合物用于作為〇2'和多硫化氨聯(lián)動(dòng)檢測(cè)的巧光探針，其在檢測(cè)〇2'前后 巧光探針吸收和巧光發(fā)射最大波長(zhǎng)會(huì)有改變；檢測(cè)多硫化氨前后巧光探針巧光發(fā)射強(qiáng)度會(huì) 有所改變?？捎糜谒w系、模擬生理環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)化'和多硫化氨水平的聯(lián)動(dòng)檢測(cè)，并可 大大降低外部檢測(cè)條件的干擾，提高檢測(cè)精度。本發(fā)明化合物用作巧光探針，可用于細(xì)胞內(nèi) 〇2'和多硫化氨聯(lián)動(dòng)檢測(cè)，運(yùn)對(duì)深入研究〇2'和多硫化氨在生物體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和機(jī) 理，進(jìn)一步了解〇2'和多硫化氨的生理和毒理作用具有重要的生物醫(yī)學(xué)意義。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的采用的巧光探針對(duì)化'檢測(cè)前后巧光變化。
[0021] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的采用的巧光探針對(duì)不同濃度化'與巧光強(qiáng)度的線性關(guān) 系圖。
[0022]圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的所采用的巧光探針對(duì)化?的選擇性示意圖；其中，橫 坐標(biāo)從左至右依次為：空白、超氧陰離子、徑基自由基、雙氧水、脂質(zhì)過氧化物、枯締氨過氧 化物、過氧化叔下醇、一氧化氮、過氧化亞硝、次氯酸。
[0023] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的所采用的巧光探針對(duì)多硫化氨檢測(cè)前后巧光光譜的 變化。
[0024] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的采用的巧光探針對(duì)不同濃度的Na2S4與巧光強(qiáng)度的線 性關(guān)系圖。
[00巧]圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的所采用的巧光探針對(duì)多硫化氨的選擇性示意圖；其 中，橫坐標(biāo)從左至右依次為：空白、過硫化鋼、多硫化氨、化C&SAC&Ph、多硫半脫氨酸、斜方 硫、硫氨化鋼、谷脫甘膚、半脫氨酸、高半脫氨酸、脫氨酸、氧化型谷脫甘膚、生育酪、抗壞血 酸。 陽0%] 圖7為細(xì)胞對(duì)照組。
[0027] 圖8為超氧陰離子處理組。
[0028] 圖9為多硫化氨處理組。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于實(shí)施例。
[0030] 巧光探針通式為：
[0031]
[0032]
[0033] 通式I中，
[0034] Ri為Cl 22烷基、面代芐基或Ci-Ci2有機(jī)酸醋鏈；R2為氨、橫酸基、氨基、簇基、硝基或 面素；X(定位功能基團(tuán)）為氨、下基S苯基鱗基團(tuán)、N-丙基嗎嘟基、生物素基、葉酸基、糖基 鏈基、芐基氯或。22烷基；Yi為N、0或S;Y2(檢測(cè)基團(tuán)）為N、0或S。 陽0對(duì)優(yōu)選為； 陽036] 檢測(cè)基團(tuán)Y2處所引入的取代基為間硝基苯基團(tuán)，Y1為0,X為H時(shí)，所述花菁類化 合物的通式為：
[0037]
陽03引 通式II中：
[0039] Yi為N，Ri為乙基鏈，Rz為氨，時(shí)；
[0040] 將通式I與待測(cè)定水體、模擬生理環(huán)境或生物體內(nèi)外的超氧陰離子反應(yīng)從而導(dǎo)致 巧光強(qiáng)度的改變，所得通式III結(jié)構(gòu)的化合物；
[0041 ]
[0042] 將通式III與待測(cè)定水體、模擬生理環(huán)境或生物體內(nèi)外的多硫化氨反應(yīng)從而導(dǎo)致 巧光強(qiáng)度的改變，所得通式IV結(jié)構(gòu)的化合物；
[0043]
[0044] 將通式II結(jié)構(gòu)應(yīng)用于檢測(cè)超氧陰離子時(shí)，與〇2'作用后，生成具有通式VI結(jié)構(gòu)的 化合物，從而導(dǎo)致巧光強(qiáng)度的改變；
[0045]
[0046] 將通式VI結(jié)構(gòu)應(yīng)用于檢測(cè)多硫化氨時(shí)，與多硫化氨作用后，生成具有通式VII結(jié) 構(gòu)的化合物，從而導(dǎo)致巧光波長(zhǎng)的改變；
[0047]
陽048] 通式II可對(duì)〇2'或多硫化氨進(jìn)行定性、定量的檢測(cè)。
[0049] 本發(fā)明中使用的術(shù)語"有機(jī)酸醋鏈"包括直鏈有機(jī)酸醋基和支有機(jī)酸醋基。如提 及單個(gè)烷基如"丙基"，則只特指直鏈烷基，如提及單個(gè)支鏈烷基如"異丙基"，則只特指支鏈 烷基。類似的規(guī)則也適用于本說明書中使用的其它基團(tuán)。
[0050] 本發(fā)明中使用的術(shù)語糖基指單糖、雙糖、類單糖或類雙糖。
[0051] 實(shí)施例1.花菁類化合物的制備：
[0052] 通式I中所示花菁類巧光團(tuán)來自市售商品，然后在巧光團(tuán)相應(yīng)的位置分別修飾上 不同的定位基團(tuán)。最后將修飾定位基團(tuán)的巧光團(tuán)和取代苯甲酸在二氯甲燒溶劑中反應(yīng)得到 的相應(yīng)的花菁類化合物。具體實(shí)施例如下：
[0053] 制備式一化合物：
[0054] 將間硝基苯酪（0. 696g，5.OOmmol)溶解在30ml無水DMF的圓底燒瓶中，室溫條 件下，加入〇.208g(60%inoil)NaH,在氣氣保護(hù)下攬拌15min。如上所述屯碳花菁巧光 團(tuán)（0. 5g，0. 83mmol)加入上述溶液，室溫?cái)埌璺磻?yīng)2地，用飽和艦化鐘溶液洗涂，二氯甲燒 萃取，旋蒸。粗產(chǎn)品用柱層析色譜進(jìn)行純化，洗脫劑選擇乙酸乙醋和甲醇（4:l/v/v)，得到 0. 293g綠色固體，產(chǎn)率50%。將上一步產(chǎn)品（0. 07g，0.Immol)溶于10ml甲醇，冰水浴下分 批滴加棚氨化鋼化〇〇57g，0. 15mmol)，反應(yīng)持續(xù)15分鐘后W稀鹽酸（10% )中和至中性， 然后二氯甲燒（100mlX3)萃取，加硫酸鋼干燥，蒸干溶劑后用硅膠柱色譜（200-300目）分 離。洗脫劑為二氯甲燒和石油酸（l:l/v/v)，收集黃色組分，蒸干溶劑后得得產(chǎn)品0.053g， 收率：75%。 陽化5]式一化合物：1hNMR巧OOMHz,CDCI3-D1) 5 (卵m) :8. 01-7. 94(m, 2H), 7. 69-7. 54(m, 4H)，7. 39-7. 22 (m,lOH) ,6.84-6. 82 (m，2H) ,6.21-6. 11 (m，2H), 5.48 (s,IH), 4.56 (s,IH), 4. 1 2-4. 06 (m, 2H)，3. 56-3. 54 (m,IH)，3. 07-3. 05 (m, 3H)，2. 85 (m, 4H)，1. 37-1. 05 (m, 18H)."CNM R(125MHz,CDCI3-D1) 5 (ppm) : 178. 01, 172. 56, 163. 12, 160. 01, 156. 03, 146. 12, 143. 43, 141 .63, 141. 29, 141. 02, 140. 40, 138. 03, 134. 20, 129. 83, 129. 42, 128. 47, 128. 04, 127. 90, 127 .01, 126. 30, 125. 08, 122. 08, 120. 85, 115. 04, 110. 58, 99. 79, 91. 25, 70. 09, 49. 00, 38. 89, 3 1. 58, 26. 62, 11. 04.LC-MS(API-E巧：m/zC4eH5〇N4〇3Calcd706. 3883,found[M-田 705. 3