胞毒性。在37°C條件下，在黑暗的C02培養器內細胞暴露于不同濃度（0、2. 5μΜ、5μΜ、 10 μ Μ、20 μ Μ)的TPE-MEM 6小時，然后在培養器的新鮮的培養基內再培養18小時進行細胞 增殖。如圖14所示，結果顯示在黑暗中TPE-MEM的濃度即使達到20 μ M也一般沒有細胞毒 性。然后正如預期的，對TPE-MEM用于選擇性的細胞膜染色進行評估。如圖15Α-1?所示， 使用CellMask? Deep Red細胞膜染色劑（C10046)進行的聯合染色實驗表明從TPE-MEM觀 察到的熒光是來自于活的HeLa細胞的細胞膜，其中該細胞膜染色劑是一種商業上可獲得 的細胞膜成像劑。通過使用共聚焦顯微鏡（CLSM LSM7 ;Carl Zeiss，Germany)的軟件，測定 圖15A和圖15B之間的重疊系數為72%。重疊系數相當高，這是由于薄層細胞膜結構以及 兩種染色劑之間的競爭抑制。與C10046相比，TPE-MEM顯示出較少的內在化作用，且對細 胞膜的成像表現出較好的成像分辨率。更甚地，通過TPE-MEM還可以清楚地看到細胞微絨 毛。除了復合染色實驗，還進行了 Z型CLSM掃描（Z-stack CLSM scanning)。
[0104] 細胞膜是在膜的界面上顯示較大負電位的細胞器，在該細胞器上磷脂雙分子層主 要由薄的兩親性磷脂雙分子層構成。因此，細胞膜目標生物染色劑通常需要符合是兩親性 的和陽離子的。協調平衡分子的疏水性和親水性以滿足細胞膜的兩親性，這對于設計新的 細胞膜生物染色劑至關重要。TPE-MEM具有兩親性和帶正荷的特性，因此將其可以作為極佳 的生物染色劑，用于特異性染色活細胞的細胞膜。兩親性的TPE-MEM自發排列在磷脂雙層， 以便使疏水尾部區域在與周圍極性液體相隔離的雙層內以及親水頭部區域被靜電吸引至 負電荷的磷酸鹽。如靜電作用力和范德瓦爾斯相互作用力（van der Waals interactions) 等導致特異性目標染色。
[0105] 對于細胞成像染色劑，耐光性是最重要的標準之一。用于特異性細胞染色的一些 AIE染色劑都是高耐光性的。螺旋狀分子結構和其聚合形成過程可以阻止氧氣擴散進入 AIE微粒內，氧氣進入AIE微粒內會氧化熒光團以及使其PL發光變白。如圖16所示，在活 細胞內得到了相似的耐光性結果。根據初始熒光強度標準化熒光強度。如圖16所示，總照 射時間5分鐘（30次掃描），TPE-MEM的信號損失少于40%。從Os至325. 7s的時間，信號 損失和成像亮度發生輕微下降，這是由于染色劑的擴散以及細胞的移動。
[0106] 如圖16所示，在CLSM時間過程中系列掃描中可以看到氣泡。明顯地，細胞絨毛 收縮并消失，然后基于激光掃描，細胞膨脹并泄露，可見細胞質膜變得不連續且是滲漏的。 這種現象強烈表明細胞死亡是由激光掃描導致的，這就激發了人們后續研究的原因。在 η-共軛體系中具有正電荷的吩噻嗪（phenothiazinium)基分子廣泛用于活性氧（ROS)生 成和光線療法。與吩噻嗪相比，TPE-MEM在Ji-共軛體系中也具有正電荷，這有可能會使得 光誘導ROS生成，導致細胞死亡。
[0107] 為了證實上述假設，使用商用ROS熒光探針H2DCFDA進行ROS檢測。當通過已存 在的ROS氧化H2DCFDA時，可以檢測到在535nm( λ ex= 488nm)發射強熒光。出人意外地， 正常的白色房間燈光（LED燈泡，3W)照射到TPE-MEM溶液時足夠產生R0S。含有H2DCFDA 的PBS溶液、含有TPE-MEM的PBS溶液以及同時含有H2DCFDA和TPE-MEM的PBS溶液的PL 光譜都是在相同的房間燈光照射得到的。記錄樣品不同照射時間的PL光譜（圖17A，λ ? =488nm)以及535nm的峰值強度與照射時間之間的相關曲線（圖17B)。在圖17A中，當 溶液中同時存在H2DCFDA和TPE-MEM時，被氧化的H2DCFDA在535nm的特征峰出現并隨著 光照射增強。測定結果顯示即使房間燈光照射時間超過120分鐘，PL強度仍然持續增強， 而紫外光照射僅幾分鐘之內就使熒光變白（未顯示數據）。單獨的H2DCFDA溶液和單獨的 TPE-MEM溶液由房間燈光照射后的PL強度變化輕微。觀察結果表明實際上是光線照射在 TPE-MEM的時候產生的ROS，導致細胞受損和死亡。
[0108] 然而，細胞死亡的病理學仍然無法解釋。細胞膜的完整性是最重要形態學特征之 一，用于區分細胞凋亡和細胞壞死。在細胞壞死的過程中，細胞膨脹，細胞膜變得有漏洞并 分裂，最終細胞與周圍環境交換物質。碘化丙陡（propidium iodide, PI)是不能滲透通過細 胞膜的，通常排除在活細胞之外。當細胞膜有漏洞時，PI常用于對死亡細胞的胞核染色。因 此，PI開放用于在大量細胞中識別死亡細胞并在多色熒光技術中作為復染色劑。在本實例 中，如圖18所示，TPE-MEM加入至具有活細胞的培養基內進行標記，然后將PI引入至觀察基 內。如圖18中的A-D所示，在光照射以前僅可以檢測到來自于細胞膜上的TPE-MEM (channel I)的黃光。當照射細胞約5分鐘（30scanS)的時候，再照射另一個5分鐘用于攝取PI，如圖 18中的E-H所示，在細胞內部的細胞質和細胞核內可以觀察到細胞形態的變化以及來自于 PI(channel II)所發的紅光。在細胞核內來自于PI所發的紅光是由于PI插入結合至DNA 導致PI發紅光，而細胞質內的紅色信號有可能是細胞核裂解進入至細胞質內造成的。在沒 有TPE-MEM的控制實驗中，在照射前（未顯示數據）和照射后（圖18中的I-L)都沒有檢測 到紅色信號（channel II)。所有觀察結果顯示細胞膜變得有漏洞，表明在存在有TPE-MEM 的情況下進行光線照射會引起細胞壞死。
[0109] 所有結果表明TPE-MEM在房間燈光照射下促使產生ROS。TPE-MEM除了具有細胞 膜選擇性和極好的耐光性，TPE-MEM可潛在用作治療癌癥的光線療法藥物。為了評估利用 正常房間燈光照射TPE-MEM的光線療法對HeLa癌細胞增殖的影響，如圖19所示，通過MTT 法，對于房間燈光照射2小時和未照射2小時兩種情況分別測定含有不同濃度的TPE-MEM 的細胞存活率。通過測定的MTT值與不含有TPE-MEM且未光照的樣品測得的MTT值之間的 關系制備標準曲線進而計算細胞存活率。
[0110] 圖19的結果顯示未經照射的細胞是有存活率且從0 μ M-IO μ M的細胞存活率約 為90%，不含有TPE-MEM的樣品經房間燈光照射后未顯示毒性。然而，經房間燈光照射的 TPE-MEM產生R0S，在含有10 μ M的TPE-MEM的細胞存活率降至47 %。在含有TPE-MEM的情 況下，經房間燈光照射的樣品與未經房間燈光照射的樣品之間得到比較大的細胞存活率差 異。白色房間燈光照射是溫和的，容易獲得且便宜，結合產生ROS的高產率，使得光線療法 無危害性、耐光、暗毒性低。所有的優點使得TPE-MEM是一種較好的光敏劑（也可以稱為感 光劑）。
[0111] 即使很難鑒定ROS物質以及說明ROS產生的機制，但卻可以觀察到ROS的產生。 ROS已經顯示出可以增強癌細胞的增殖，但過量的ROS水平會導致癌細胞凋亡和壞死。在本 實例中，細胞膜生物染色劑（TPE-MEM)通過房間燈光照射產生過量的R0S，可以實時地可視 化原位癌細胞壞死的過程。
[0112] 總之，合成的具有強AIE特性的非對稱的兩親性的四苯乙烯基吡啶鹽 (tetraphenylethene-based pyridinium salt，TPE_MEM)可用于細胞膜染色。由于陽離子 和兩親性，TPE-MEM對細胞膜具有高特異性以及在活細胞內具有極佳的耐光性。令人意外的 是，僅通過普通房間燈光照射下TPE-MEM就可以有效誘導產生ROS，導致細胞壞死。這些獨 特特征使得可以實時觀察在原位的細胞壞死的過程和光線療法的過程。因此，產生ROS和 可光線療法的結果使得本實施例的發光物可用于制備治療癌癥的新的AIE光線療法藥物。
[0113] 實施例3 :合成陰離子的兩親性發光物TPE_2Gd并對其進行應用方面的實驗研究
[0114] (1)合成 TPE-2+
[0115]
[0116] 如圖3所示，在氮氣環境下，1-(3-三甲基胺基丙烷基）-4_甲基吡啶二溴化 物(I- (3-trimethylammoniopropyl)-4-methylpyridinium dibromide)(0. 5g, I. 4mmοI) 和4-(1,2,2-三苯基乙烯基）苯甲醒（4-(1，2,2-1：1'1卩1161171￥；[1171外6112&1(16117(16) (1.0 lg，2. 8mmol)的溶液在無水甲醇中回流反應，加入三滴哌啶進行催化，冷卻至室溫后 ，在減壓條件下蒸發溶劑，通過硅膠柱色譜法對殘留物進行純化，使用二氯甲烷和甲醇（2 :lv/v)的混合溶劑作為洗脫劑，得到黃色產物TPE-2+(0. 56g，57%)。1H NMR(400MHz， 甲醇 _d4, δ ) : 8· 913 (d，2H，J = 6. 8Hz)，8· 177 (d，2H，J = 6. 8Hz)，7· 875 (d，1H，J = 16. 0Hz), 7. 501 (d, 2H, J = 8. 4Hz), 7. 352 (d, 1H, J = 16. 4Hz), 7. 120-6. 985 (m, 17H), 4.678(t,2H,J = 12. 4Hz), 3. 611 (t, 2H, J = 16. 8Hz), 3. 224 (s, 9H), 2. 600 (m, 2H) ；13C NMR (100MHz,甲醇-d4, δ ) : 153. 985, 146. 064, 143. 359, 142. 763, 142. 666, 142. 535, 141. 7 10, 141. 079, 139. 581，132. 603, 131. 121，130. 342, 130. 261，126. 910, 126. 741，125. 901，I 25. 794, 123. 366, 121. 556, 61. 776, 55. 939, 52. 015, 24. 136 ;HRMS(MALDI-T0F)m/z:計算值 ，535. 3102 [M-HBr-Brl+;測定值，537. 3263 [M-HBr-Br ?+。
[0117] (2)合成第五化合物5，并通過第五化合物5合成TPE_2Gd
[0118]
[0119] 如圖3所示，將第三化合物3(163. 3mg，0. 2mmol)、第四化合物 4 (214. 4mg, 0. Bmmol)、DCC (136. 2mg, 0· 66mmol)和 DMAP (80. 6mg, 0· 66mmol)完全溶解于 30mL的DMF中，加入3mL的三乙胺后，室溫條件下，在氮氣環境下對上述混合物攪拌48小 時，攪拌后的混合物中加入IOmL的三氟乙酸酸化30分鐘，然后過濾，在己烷中沉淀3次， 得到相應的需要的第五化合物5,產率92%。1H NMR(400MHz，DMS0-d6, δ):8.45(πι，2Η，Η of triazole 苯三唑），8· 05 (m, 2Η, H of amide 醜胺），7· 60 (m, 4Η ;H-Ar-triazole 苯三唑 )，7· 12-7. 01 (m，14H ;H-Ar)，4· 53 (s，4H ;CH2-triazole 苯三唑），3· 83 (m，4H ;CH2C-triazole 苯三唑），3. 57-3. 13(m，20H ;0CH2)，3. 02(s，20H ;CH2C = 0)，2. 90(s，20H ;NCH2) ;13C NMR(10 0MHz, DMS0-d6, δ ) ： 172. 6, 169. 2, 145. 9, 143. 0, 142. 6, 140. 4, 131. 3, 130. 7, 129. 0, 127. 9, 126. 7, 124. 6, 121.