檢測過氧化亞硝基的熒光探針及制備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬生物檢測領域，涉及一類檢測過氧化亞硝基的熒光探針及其制備方法和 應用。
【背景技術】
[0002] 過氧化亞硝基是活性氮家族的一員，是生物體內硝化應激反應的產物之一，在體 內由一氧化氮自由基及超氧陰離子合成。由于其強氧化性及強親核性，過氧化亞硝基可以 與體內眾多的生物分子，包括蛋白質、金屬酶、脂質、核酸等反應，引起機體氧化損傷最終導 致細胞凋亡。事實上，目前過氧化亞硝基被廣泛認為是一氧化氮自由基及超氧陰離子產生 細胞毒性的罪魁禍首，并參與心血管疾病、神經退行性疾病等疾病的發生發展。而另一方 面，過氧化亞硝基也被報導可作為信號分子或細胞毒效應子清除體內入侵病原體，從而發 揮積極的機體保護作用。近期研宄表明，過氧化亞硝基可通過硝化蛋白質酪氨酸殘基而參 與到酪氨酸磷酸化信號通路中。目前，人們對過氧化亞硝基在生物體內的生理及病理角色 仍充滿爭議。因此，發展能對生物體內的過氧化亞硝基進行實時追蹤檢測的方法，可極大推 動過氧化亞硝基相關的生理病理學研宄。
[0003] 傳統的檢測過氧化亞硝基的方法基本依賴于其下游反應產物一一3-硝基酪氨酸 的檢測。這種檢測方法存在特異性差、不能適用于活體檢測等兩方面的問題。熒光探針檢 測法是近幾年來發展起來的新方法。該方法利用過氧化亞硝基的氧化性或親核性，設計可 與過氧化亞硝基特異性反應的熒光探針，這些熒光探針本身無熒光，與過氧化亞硝基反應 后可生成具有強熒光的產物，因而可用于過氧化亞硝基的靈敏檢測。由于小分子熒光探針 具有體積小、生物膜通透性良好的優點，因而熒光探針法除適用于檢測血漿、組織勻漿中的 過氧化亞硝基，還適用于活細胞甚至是動物組織中過氧化亞硝基的檢測。
【發明內容】
[0004] 本發明的一個目的是提供一類新型的特異性檢測過氧化亞硝基的小分子熒光探 針，具有式Ia或Ib所示的結構通式：
其中： X為硫或氧原子； Y為氧原子，或者烷胺基、芳胺基； R1為羥基、烷基仲胺或芳基仲胺； R2為氫，氟原子或溴原子、C ^C4烷基，或者供電性基團如烷氧基、烷胺基等； 馬為氫或烷氧基； R4為氫、C ^C4烷基，或者供電性基團如烷氧基、烷胺基等； 本發明的又一個目的是提供式Ia及Ib所示化合物的制備方法，通過以下兩種制備方 法實現： (1)式Ia化合物的制備方法： R4基取代的鄰氨基苯硫酚或者R4取代的鄰氨基苯酚與RpR2取代的苯甲醛在甲醇溶液 中室溫攪拌兩個小時，抽濾，即得式la。
[0005] (2)式Ib化合物的制備方法： A. R4基取代的鄰氨基苯硫酚或者R4取代的鄰氨基苯酚與R2取代的鄰羥基苯甲醛在甲 醇溶液，雙氧水及鹽酸共同存在的條件下室溫反應得中間體II ; B. 中間體II在二氯甲烷溶液中，吡啶存在的條件下與三氟甲磺酸酐反應，得中間體 III ; C. 中間體III與R3取代的對羥基苯叔丁基二甲基硅醚或者R 3取代的對氨基苯叔丁基 二甲基硅醚在醋酸鈀存在下偶聯，后經苯胺氮原子甲基化、羥基脫除硅醚保護基，得Ib所 示探針。
其中： X為硫或氧原子； Y為氧原子，或者烷胺基、芳胺基； R1為羥基、烷基仲胺或芳基仲胺； R2為氫，氟原子或溴原子、C ^C4烷基，或者供電性基團如烷氧基、烷胺基等； 馬為氫或烷氧基； R4為氫、C ^C4烷基，或者供電性基團如烷氧基、烷胺基等。
[0007] 本發明的再一個目的是提供式Ia或Ib所示的熒光探針在檢測生物過氧化亞硝基 中的應用。本發明以活細胞中的應用為例，可通過以下步驟實現：細胞培養基中加入式Ia 或Ib所示的熒光探針，使其終濃度為5 μ M，37 °C下孵育30分鐘，觀察記錄細胞熒光強度， 本發明提供的熒光探針的特征在于它本身在生理環境中只有微弱的熒光，但可與過氧化亞 硝基特異性快速反應，生成具有強熒光的產物，實現3倍至600倍的熒光增強，從而實現對 過氧化亞硝基的特異性檢測和定量分析。
[0008] 本發明涉及的熒光探針具有以下有益效果：（1)穩定性好，能夠長期保存使用； (2)具有較大的吸收發射波長差（>100nm)，能夠有效避免激發光的干擾；（3)由于探針本身 無熒光，只有在與過氧化亞硝基反應后才有熒光，因此，檢測信噪比高，靈敏度好；（4)具有 優秀的選擇性，能在復雜生物樣品中特異性地檢測過氧化亞硝基；（5)具有良好的生物膜 通透性，因而能用于活細胞中過氧化亞硝基的檢測；（6)具有較好的雙光子吸收截面，能用 于雙光子顯微鏡下觀測。
【附圖說明】
[0009] 圖1是熒光探針分子Ia-I與過氧化亞硝基反應前后的熒光變化。
[0010] 圖2.熒光探針分子Ib-I與過氧化亞硝基反應前后的熒光變化。
[0011] 圖3.熒光探針分子Ib-2與過氧化亞硝基反應前后的熒光變化。
[0012] 圖4是熒光探針分子Ia-I對過氧化亞硝基的選擇性。
[0013] 圖5是熒光探針分子Ib-I對過氧化亞硝基的選擇性。
[0014] 圖6是熒光探針分子Ib-2對過氧化亞硝基的選擇性。
[0015] 圖7是熒光探針分子Ib-2對過氧化亞硝基濃度依賴性熒光增強。
[0016] 圖8是熒光探針分子Ib-I檢測活細胞血管內皮細胞中過氧化亞硝基。
[0017] 圖9是熒光探針分子Ib-I檢測2種活細胞中過氧化亞硝基。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合附圖和實施例對本發明做進一步說明，以下的實施例不是限制本發明的 范圍。
[0019] 實施例1 :焚光探針分子Ia-I的制備 Ig鄰氨基苯硫酚（8毫摩爾）與鄰羥基苯甲醛（8毫摩爾）在SmL甲醇中室溫攪拌兩 個小時，抽濾，得白色固體2- (2, 3-二氫苯并[d]噻唑-2-基）苯酚。即得la-Ι，收率 50%。1H NMR (500 MHz, DMS0) δ 9. 85 (s，1H)，7. 4 (d，1H)，7. I (t，1H)，6. 95 (d，1H)， 6. 75-6. 85 (m，3H), 6.65 (d，2H), 6.55 (t，lH), 6.45 (s，lH)。
[0021] 實施例2 :焚光探針分子Ib-I的制備 鄰氨基苯硫酚（0. 5g，3. 6毫摩爾)與鄰羥基苯甲醛（0. 438g，3. 5毫摩爾)溶解在5mL甲 醇溶液中，冰浴下滴加37%的過氧化氫（15. 75毫摩爾)然后再滴加37%鹽酸（9. 2毫摩爾)， 室溫反應兩個小時抽濾，乙醇重結晶，得中間體2-(苯并[d]噻唑-2-基）苯酚即11-1，收 率70%;中間體II-I (0.5g，2毫摩爾）首先用20毫升無水二氯甲烷攪拌溶解，氮氣置換， 冰浴下向反應液中首先滴加吡啶溶液（328μL, 4毫摩爾)，然后再向反應液中勻速緩慢滴加 三氟甲磺酸酐（〇.863g，3毫摩爾），室溫攪拌3-4小時。反應完畢用乙酸乙酯萃取，無水硫 酸鈉干燥，柱層析純化，得中間體2-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基三氟甲磺酸即III-I ;中間 體III-I (0. 25g，0. 7毫摩爾)與4 -((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯胺（0. 2g，0.8毫摩 爾)、醋酸鈀（3%毫摩爾）、BINAP (4. 5%毫摩爾）和碳酸銫（1. 4毫摩爾）溶解在4mL甲苯中， 80攝氏度反應16小時，抽濾，柱層析純化。得黃色2-(苯并[d]噻唑-2-基）-N-苯基苯 胺類關鍵中間，收率80%，該中間體經N-甲基化，脫羥基保護基得探針分子Ib-I，收率68%。 1HNMR (500 MHz, DMS0) δ 9. 8 (s, 1H), 5 8.85 (s, 1H), 8. 5 (dd, ^10, 1H), 8.05 (t, 1H), 7.6 (m, 1H), 7.55 (m, 2H), 6.64 (d，2H), 6.55 (d, 2H), 3.1 (s, 3H)。
[0023] 實施例3 :焚光探針分子Ib-2的制備 中間體2-(苯并[d]噻唑-2-基）苯基三氟甲磺酸酯（0. 25g，0. 7毫摩爾）與4 -((叔 丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3_甲氧基苯胺（0. 25g，0.8毫摩爾)、醋酸鈀（3%毫摩爾)、BINAP (4. 5%毫摩爾）和碳酸銫（1. 4毫摩爾）溶解在4mL甲苯中，80攝氏度反應16小時，抽濾，柱 層析純化。得黃色2-(苯并[d]噻唑-2-基)-N-苯基苯胺類關鍵中間，收率80%;該中間體 經N-甲基化，脫羥基保護基得探針分子lb-2,收率65%。 1HNMR (500 MHz，DMS0) δ 10. 4 (s，lH)，8.15(d，1Η)，8.05 (d，1Η), 7.8 (d，1Η), 7.55 (t, 1Η), 7.45 (t，lH), 7.3 (m, 2H),