一種溫敏性智能熒光納米探針及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種溫敏性智能熒光納米探針及其制備方法，屬于生化領域。
【背景技術】
[0002]隨著生命科學不斷深入研宄，一些研宄細胞環境的傳統方法在應用時，無法做到在活細胞生理條件下實時的對細胞內微環境進行動態監測。熒光共振能量轉移技術(FRET)技術成功解決了這一難題。該技術適用于活細胞和固定細胞的各類分子，靈敏度和分辨率高，并能清晰成像，能夠直觀地提供蛋白質相互作用的定位和定量信息。蛋白質傳感器作為一種蛋白質與其他分子之間作用力的手段已經越來越顯示出其優點。在FRET中，選擇合適的供體-受體對能夠保證高效的能量轉移。半導體量子點(Qdots)由于其可調諧的發射波長、狹窄且對稱的發射峰、寬的激發波、抗光漂白性和可同時連接多個染料分子等優點，使其成為比有機熒光分子更好的熒光共振能量轉移的供體。
[0003]使用功能高分子對Qdots和有機熒光分子進行可控組裝，可實現熒光共振能量轉移(FRET)，通過調控功能高分子的分子結構和聚集態結構，通過環境的刺激，在不同pH值、溫度、溶劑等環境下改變Qdots和有機熒光分子的間距，FRET效率隨之發生相應的變化。
[0004]Medintz I L，Clapp A R等把量子點修飾的麥芽糖結合蛋白(MBP)和染料標記的環糊精(β-CD)作為FRET的供體、受體對，提出了麥芽糖粘附蛋白(MBP)的麥芽糖生物傳感器的設計方案。他們還利用多個麥芽糖粘附蛋白(MBP)標記光敏性的1，3，3-三甲基-螺[2，2-吲哚啉2Η-1-苯并吡喃](簡稱BIPS)來反向調節量子點的發射光譜，調節的效率可以通過改變BIPS的數量來進行控制，以此實現光敏性開關的裝置或生物傳感器。Medintz I L，Trammell S A等將抗-TNT特定抗體片段通過金屬吸附作用連接到親水的熒光量子點上，完成了溶液相納米尺度傳感器的組裝。Wei Q D，Lee M等以量子點作為一種新型的熒光探針，標記雌激素受體β (ER-β)的單克隆抗體，用有機熒光染料AlexaFluor (AF)標記ER- β的多克隆抗體，而后通過量子點與有機熒光染料之間的FRET檢測探針間的距離。但是目前，對于將溫敏性聚合物與量子點進行可控組裝制備溫敏性智能化熒光納米探針的研宄還鮮有報道。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術存在的不足而提供一種溫敏性智能熒光納米探針及其制備方法，具有溫敏性和熒光性雙重響應，通過宏觀可視的熒光性質，達到實時監測的目的。
[0006]本發明為解決上述提出的問題所采用的技術方案為:
[0007]一種溫敏性智能熒光納米探針，其以溫敏性聚合物修飾的量子點作為供體、有機熒光分子作為受體組裝而成，所述量子點的發射光譜與有機熒光分子的吸收光譜有重疊。
[0008]按上述方案，所述量子點為ZnS單核量子點、CdS單核量子點、CdSe單核量子點、CdSe/ZnS 核 / 殼量子點、CdSe/CdS/ZnS 核 / 殼 / 殼量子點、CdxZrvxS 量子點、CdSeAMxZrvxS核/合金殼量子點等中的任意一種。
[0009]按上述方案，所述溫敏性聚合物為溫敏性雙端氨基聚合物或一端帶氨基一端帶巰基的聚合物，分子量在3000以下。其中，所述溫敏性雙端氨基聚合物可以選自雙端氨基聚乙二醇(AT-PEG)、雙端氨基偶氮聚合物、端氨基聚醚、聚鄰苯二胺、雙氨基聚氨酯(如雙端氨基甲酸酯)等聚合物；所述一端帶氨基一端帶巰基的聚合物選自巰基苯胺聚合物、氨基-聚乙二醇-巰基等聚合物。該類溫敏性聚合物具有一定生物相容性和特定官能團，其分子鏈的末端距隨周圍環境PH值、溶劑、溫度的變化而變化，分子鏈末端的距離變化范圍為l-20nm，pH值的變化幅度為4_10，溫度和溶劑隨分子結構的不同而不同。
[0010]按上述方案，所述有機熒光分子為含羧基的有機熒光分子，可以選自含羧基的羅丹明B、異硫氰酸熒光素和羧基熒光素(如5-FAM、6-FAM)、二氫醋酸熒光素等中一種。由于本發明中的量子點經溫敏性聚合物修飾，溫敏性聚合物修飾的量子點含有氨基或巰基，所以有機焚光分子選用含羧基的有機焚光分子。
[0011]上述溫敏性智能熒光納米探針的制備方法是:先用溫敏性聚合物對量子點進行修飾，然后將溫敏性聚合物修飾后的量子點與有機熒光分子進行可控組裝，從而制得溫敏性的新型智能化熒光納米材料。
[0012]按上述方案，所述溫敏性聚合物對量子點進行修飾的方法，具體包括如下步驟:
[0013]I)將量子點溶于氯仿中，并加入溫敏性聚合物，待完全溶解后于20?45°C下超聲2 ?8h ;
[0014]2)向步驟I)所得溶液中滴加pH為8?10的緩沖溶液，繼續超聲12?24h，然后靜置分層，分離出上層水溶液并用氯仿洗滌以除去有機雜質，再經透析，即得到溫敏性聚合物修飾后的量子點水溶液。
[0015]上述方案中，所述步驟I)中溫敏聚合物相對于量子點是過量的以保證修飾的充分進行，本發明中溫敏性聚合物與量子點的摩爾比在80以上，其中過量的溫敏聚合物會在后續的透析步驟中除去。
[0016]上述方案中，所述步驟2)中所述緩沖液為的pH范圍為8?10，可以選用PBS緩沖液或者Tris-HCl緩沖液等。其中PBS緩沖液，是磷酸二氫鉀與磷酸氫二鈉的混合溶液；Tris-HCl緩沖液的pH范圍也為8?10，是三羥甲基氨基甲烷溶液與鹽酸的混合液。
[0017]上述方案中，所述步驟2)中的緩沖液的體積為步驟I)所得溶液I?2倍為宜。
[0018]上述方案中，所述步驟2)中透析的時間為24?72h。
[0019]按上述方案，溫敏性聚合物修飾后的量子點與有機熒光分子可控組裝的方法，具體包括如下步驟:
[0020]a)將有機熒光分子、1-乙基-3-(3-二甲氨基)_碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在水中攪拌2?4h，然后加入溫敏性聚合物修飾后的量子點水溶液，攪拌I?4h ；
[0021]b)加堿調節步驟a)所得溶液pH為8?10，并攪拌30min?2h ;然后滴加pH為6.8?8.2的緩沖溶液并超聲12?24h，再經透析、真空干燥，即得到得溫敏性智能熒光納米探針。
[0022]上述方案中，所述步驟a)中有機熒光分子、1-乙基-3- (3_ 二甲氨基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比范圍為1:1?1.2:1?1.2。其中，步驟a)中水的加入量為有機焚光分子質量的200-400倍為宜，有機焚光小分子約為量子點質量的10-30 倍。
[0023]上述方案中，所述步驟b)中的堿為四甲基氫氧化銨(TMAOH)。
[0024]上述方案中，所述步驟b)中緩沖液pH范圍為6.8?8.2，可以選用HEPES緩沖溶液，是4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液與NaOH溶液的混合液。
[0025]上述方案中，所述步驟b)中透析的時間為24?72h，真空干燥的時間為24?48h。
[0026]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0027]第一，本發明所述的溫敏性智能熒光納米探針具有溫敏性和熒光性雙重響應性，通過環境刺激，熒光共振能量轉移效率隨之發生變化，可以通過宏觀熒光達到實時監測的目的；
[0028]第二，本發明所述的溫敏性智能熒光納米探針熒光共振能量轉移效率高，并且隨著環境變化，熒光共振能量轉移效率變化大，即反應靈敏。
【附圖說明】
[0029]圖1為CdSeAMxZrvxS量子點的熒光發射譜和羅丹明B的吸收譜。
[0030]圖2?5分別為實施例1、2、3、4制備溫敏性智能熒光納米探針在25°C下的熒光共振能量轉移圖譜，熒光共振能量轉移效率按E = 1_Fda/Fd關系式計算出，其中Fda為受體存在時供體的熒光強度，Fd為受體不存在時供體的熒光強度。
[0031]圖6為實施例4制備溫敏性智能熒光納米探針在不同溫度下得到熒光共振能量轉移圖譜。
[0032]其中，QDs表示量子點，RhB表示羅丹明B，FRET_1、FRET-2、FRET-3、FRET_4分別對應實施例1、2、3、4制備溫敏性智能熒光納米探針。
[0033]圖7為實施例1?4中所用CdSeAMxZrvxS量子點的透射電鏡(TEM)圖像。
[0034]圖8為實施例5?6中所用CdxZrvxS量子點的TEM圖像。
【具體實施方式】
[0035]為了更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明不僅僅局限于下面的實施例。
[0036]實施例1?4中所用CdSeAMxZrvxS量子點的制備:
[0037]準確稱取4mmo1乙酸梓(ZnAc2)、0.2mmo1的CdO、5ml油酸和15ml的1-十八稀(ODE)放入10ml的三口燒瓶中，在150°C左右反復抽真空30min后，通入氮氣作為保護氣體，將溫度升高到300°C，以得