一種磁性熒光復合納米生物探針及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種多功能納米復合微球的制備方法，具體涉及一種磁性熒光復合納米生物探針及其制備方法，該復合微粒同時具備了量子點的熒光性能和磁性納米顆粒的磁性能，可用作生物體內靶向定位和生物熒光成像方面。
【背景技術】
[0002]在生物標識方面，發光的半導體量子點顯示出很大的優勢。與有機發光材料相比，發光的半導體量子點發射譜窄，能夠實現從紫外、可見到紅外的可調發光，并且具有寬的激發帶，可以利用單一波長的光進行激發而得到不同波長的發射光；同時，半導體量子點具有良好的光穩定性和抗光漂白性，其所固有的窄發射帶，使其具有良好的測試靈敏度。理想的磁性熒光微球要求具有較高的比飽和磁化強度、能產生較強的熒光且熒光穩定性良好、微球尺寸可控、粒徑分布窄、化學穩定性好、表面含有豐富的功能基團，且制備工藝簡單、重復性良好、價格便宜等特點，它不僅可以作為核磁共振造影劑用于疾病診斷，還可以作為藥物載體用于疾病治療以及各種蛋白、細胞等的分離。因此，如果將具有熒光的量子點和磁性材料相結合，得到一種新型的雙功能磁性焚光納米粒子，在分離的同時還能進行光學檢測，這將在生物標記、生物分離、免疫檢測、藥物靶向釋放、目標成像等方面具有很大的應用潛力。
[0003]目前，制備磁性熒光復合納米顆粒的方法很多，綜合國內外研宄現狀，熒光磁性復合納米微粒的制備方法主要有以下幾種:第一，磁性材料表面包覆熒光物質；第二，熒光顆粒表面包覆一層磁性物質；第三，將分別具有磁性和熒光的兩種納米粒子同時包裹在二氧化硅或其他高分子材料中。
[0004]經對現有的技術檢索發現，郭廣生等(公開號:CN103372407A，名稱:一種磁性熒光復合納米球的制備方法)通過在Fe3O4顆粒表面首先包覆S12殼層，再通過硅烷偶聯劑KH-550對Fe3O4OS12表面進行氨基修飾，然后將CdSe QDs通過羧基與氨基之間的靜電力負載到S12表面，得到終產物磁性熒光復合納米球。這種通過靜電吸引作用將量子點與磁性納米顆粒連接的方法，由于靜電作用力相對較弱，量子點容易從磁性納米顆粒表面脫落，同時，結合后量子點裸露在復合納米微粒表面，量子點容易受到環境等其他因素的影響，導致熒光強度降低。羅陽等(公開號:CN102703601A，名稱:多功能磁性熒光微球及其制備方法和應用)通過橋連DNA連接磁性納米材料和量子點，同時分別用生物素和鏈霉親和素標記DNA和磁性材料，利用生物素與鏈霉親和素、氨基與羧基之間的結合力進行連接，制備磁性熒光復合納米微粒，該方法制備過程需要用不同的生物分子修飾顆粒表面，使其帶有不同的功能基團，制備過程復雜，同時DNA、生物素和親和素對制備和存放環境要求苛刻。
[0005]為了克服現有技術的不足，本發明通過反相微乳液法，以天然有機高分子為基體，通過交聯劑的交聯作用連接羧甲基殼聚糖修飾的磁性納米顆粒和水溶性量子點，最終得到生物相容性良好的磁性熒光復合納米微粒。由于羧甲基殼聚糖對磁性微粒的修飾作用，有效避免了磁性材料的泄漏及對量子點的熒光淬滅作用；以天然有機高分子為基體，將量子點和磁性微粒包裹在微球里面，作為一種良好的生物有機載體，它具有良好的生物相容性，可降解性。同時有機分子上有大量羥基、氨基等可反應性活性基團，可以利用降解、化學改性等方法改善其溶解性能，增加其水溶性。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種磁性熒光復合納米生物探針的制備方法，該方法制備的復合納米微粒具有磁響應性強、光穩定性高、制備簡單、分散性好且尺寸均勻等優點，與單一功能的熒光材料和磁性材料相比，同時具有熒光和磁性的多功能納米復合材料在納米生物技術中具有更廣泛的生物醫學應用，如細胞分離及識別、細胞多模式成像分析、活體成像、生化標記及傳感等。
[0007]本發明是通過以下措施實現的:
一種磁性熒光復合納米生物探針的制備方法，采用以下步驟:
(a)采用共混包埋法制備羧甲基殼聚糖磁性納米復合物(CMCH-MNPs):①稱取50-500mg磁性納米顆粒溶于30 mL pH =7.4，濃度為0.01mol/L的PBS緩沖溶液中，通氮氣去氧，利用超聲波清洗機將磁性粒子分散均勻；②稱取10-800 mg羧甲基殼聚糖溶于20 mLPBS=7.4的緩沖溶液中，同時加入0.1-0.5 g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)活化羧甲基殼聚糖表面的基團將①和②兩溶液混合，在恒溫水浴振蕩器中25°C振蕩2-6 h，在震蕩過程中緩慢滴入濃度為5-20 mg/mL的CaCl2溶液，進行離子交聯共混包覆，反應結束后用磁鐵收集產物，再依次用蒸餾水和PBS ( pH=7.4)緩沖溶液充分洗滌，即得到羧甲基殼聚糖磁性納米復合物；
(b)采用反相微乳液法制備磁性熒光復合納米微球:
取5-20 mL油相環己烷，1-5 mL表面活性劑曲拉通-100，1-5 mL助表面活性劑正己醇和適量水加入三口瓶中，攪拌30-60min形成均勻的微乳液；將步驟(a)中制備的0.005-0.03 g羧甲基殼聚糖磁性納米復合物加入天然有機高分子溶液中，超聲20-60 min，使磁性納米微粒分散均勻得到反應溶液A;取制備的濃縮的水相量子點溶于蒸餾水中，得到反應溶液B ;將A和B逐滴加入反相微乳液體系中，攪拌30-50 min后加入交聯劑，常溫下攪拌反應10-30 h，用丙酮破乳，離心分離，再依次用乙醇和蒸餾水交替洗滌，即得到磁性熒光復合納米微球。
[0008]本發明中制備的磁性熒光復合納米顆粒，其表面帶有氨基、羥基和羧基，但對于連接生物分子所需的官能團數量來說還是比較少的，羧基、氨基、巰基、聚乙二醇基都能與生物分子進行選擇性連接，因此將復合納米顆粒制成探針時，為了更好的用于生物應用，可在復合納米顆粒表面再進行表面官能團修飾，增加復合顆粒上原有官能團的數量。
[0009]本發明中所述的磁性熒光復合納米微球，對所得到的磁性熒光復合納米顆粒進行表面官能團修飾，包括以下具體步驟:將磁性熒光復合納米顆粒分散到水中，加入含有官能團的烷氧基硅烷試劑，攪拌1-36 h，離心分離，得到表面官能團修飾的磁性熒光復合納米顆粒；所用的含有官能團的燒氧基娃燒試劑包括:氣丙基二甲氧基娃燒、氣乙基二甲氧基娃烷、氨甲基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基三乙氧基硅烷、氨甲基三乙氧基硅烷、氨甲基三丙氧基硅烷、氨乙基三丙氧基硅烷、氨丙基三丙氧基硅烷、巰丙基三甲氧基硅燒、疏乙基二甲氧基娃燒、疏甲基二甲氧基娃燒、疏丙基二乙氧基娃燒、疏乙基二乙氧基娃燒、疏甲基二乙氧基娃燒、疏甲基二丙氧基娃燒、疏乙基二丙氧基娃燒、疏丙基二丙氧基娃烷。
[0010]本發明中所述的磁性納米顆粒(MNPs)為具有超順磁、順磁或鐵磁性的金屬及金屬氧化物，選自Fe3O4、Fe2O3、MeFe2O4 (Me=Co、Mn、Ni)、化合物釹鐵硼、釤鈷等、金屬Fe、Co、Ni以及合金Fe2Co、Ni2Fe的金屬氧化物的納米顆粒。
[0011]本發明中所述的磁性熒光復合納米微球的粒徑為10-220 nm。
[0012]本發明中所述的磁性納米顆粒的制備方法包括共沉淀法、水熱法。
[0013]本發明中所述的量子點為表面帶有親水基團的水溶性量子點，量子點為I1-VI，II1-V族半導體材料，或者為I1-VI和II1-V族半導體材料形成的復合材料，所述量子點粒徑為 1.5-10 nm ;優選的量子點為 ZnSe, CdSe, CdTe, CdS, ZnSe/ZnS、CdS/ZnS、CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、ZnxCd1^xSe, CdSe1^xSx, CdSe1^xTex, CdSe/ZnSe、CdS/ZnSe、CdTe/ZnSe、CdSe/CdS、CdTe/CdS'CdS/ZnxCdgS'ZnSe/ZnxCdgS'CdSe/ZnxCdgS'CdTe/ZnxCdgS，其中 0 < X < I。
[0014]本發明中所述的天然有機高分子包括殼聚糖、羧甲基殼聚糖、明膠。
[0015]本發明中所述的磁性熒光復合納米微球，步驟(a)中羧甲基殼聚糖的分子量為2X 105-2.5 X 105，羧甲基殼聚糖在磁性納米顆粒表面的厚度為3-10 nm。
[0016]本發明所述的磁性熒光復合納米微球，步驟(b)中交聯劑包括甲醛、乙二醛、戊二醛，濃度為4%-15%。
[0017]本發明所述的磁性熒光復合納米微球，步驟(b)中羧甲基殼聚糖磁性納米復合物與量子點的摩爾比為1:1-1:20。
[0018]本發明所述的磁性納米顆粒表面含有羥基、氨基、羧基中的至少一種。
[0019]本發明所述的量子點表面含有巰基、羧基、氨基中的至少一種；半導體量子點合成中所使用的親水基團配體包括3-巰基丙酸、巰基乙酸、L-半胱氨酸、2-巰基丙酸、巰基丁酸、巰基戊