氮摻雜石墨烯量子點的制備方法及抗壞血酸的檢測方法與流程

本發明屬于熒光檢測技術領域，尤其涉及一種氮摻雜石墨烯量子點的制備方法及抗壞血酸的檢測方法。

背景技術：

抗壞血酸(aa)又稱維生素c，大量存在于食品、動物體液及人體中，廣泛參與機體的氧化、還原等代謝過程，其在生物化學過程中起著至關重要的作用，是生命體中重要的抗氧化劑、輔酶因子及神經傳遞素相關酶的組成成分。眾所周知，aa的缺乏將導致壞血病的發生，但是攝入過量也會引起尿結石、腹瀉、胃痙攣等。因此，準確、簡便地檢測aa的含量是至關重要的。

傳統的用于抗壞血酸檢測的方法主要有：光學法、色譜法、電化學法、流動注射分析法、高效液相色譜法等，然而這些方法存在設備費用昂貴、操作復雜和費時等缺點。因此發展簡單、快速、低成本的抗壞血酸檢測技術對環境、生命、醫學以及工農業生產等都具有重要的意義。近年來，人們致力于抗壞血酸檢測的化學傳感器的研究。其中，熒光傳感法(即熒光探針法)成為了當前廣泛應用的分析方法。熒光傳感法因其靈敏度高和便捷等優點，是檢測重金屬、有機小分子等物質的強有力的工具。但是常用的熒光探針如半導體量子點和有機熒光分子，或者毒性高或者光穩定性差。

石墨烯量子點(graphenequantumdots，gqds)是一種由少數幾層石墨烯片組成的碳基納米材料，具有化學惰性高、毒性低、生物相容性好和光穩定性高等優點，在超級電容器、光伏器件、生物成像等領域具有廣泛的應用。目前合成gqds的方法主要有兩大類：自上而下和自下而上法。這兩種制備方法各有優缺點，例如自下而上法可以較好地調控gqds的尺寸和形貌，但是其合成過程不僅耗時而且需特定的有機前驅體，更重要的是所制備的gqds水溶性差、分散性低。相對而言，自上而下法可以簡便、大規模地制備水溶性的gqds。但是這種方法也具有分離困難、尺寸難以控制等缺點。為了獲得粒徑及層數可控的石墨烯量子點，一些科研人員發展了一種限域空間內制備gqds的方法。例如：有課題組采用自下而上的方法，在層狀鎂鋁水滑石材料的二維限域空間內插層了檸檬酸鹽，并在二維空間的限域作用下，通過水熱處理檸檬酸鹽，獲得了層數可控的石墨烯量子點。但是，如何利用納米級反應空間，采用自上而下的方法，限域制備粒徑可控的高性能熒光氮摻雜石墨烯量子點，還未被開發出來。

技術實現要素：

鑒于此，本發明的目的在于提供一種氮摻雜石墨烯量子點的制備方法及抗壞血酸的檢測方法，本發明提供的方法可獲得尺寸均一、光穩定性高的氮摻雜石墨烯量子點，以其作為熒光探針，可快速完成抗壞血酸的檢測，且準確性良好。

本發明提供了一種氮摻雜石墨烯量子點的制備方法，包括：

a)將碳氮源、三甲基苯、硫酸和乙醇混合后注入有序介孔二氧化硅中，在60～100℃下加熱2～8h，再在120～180℃下反應3～10h，然后在700～1000℃氮氣氣氛下加熱1～5h，得到碳/氮/二氧化硅納米復合物；所述碳氮源為吡咯或喹啉；

b)將所述碳/氮/二氧化硅納米復合物在濃硝酸蒸汽中反應，得到氮摻雜石墨烯量子點。

本申請以有序介孔二氧化硅作為納米反應器，將其介孔孔壁上覆蓋少層含氮石墨烯形成有序介孔n/c/二氧化硅納米復合物，然后使用硝酸蒸汽作為剪刀制備出了尺寸可控、水溶性好的n-gqds。更重要的是，n/c/二氧化硅的介孔結構利于n-gqds的快速分離，從而避免了復雜、乏味的離心過程。此外，將未反應的n/c/二氧化硅在空氣條件下煅燒去除碳成份，可以回收利用此納米反應器。總之，所用的酸蒸汽切斷法和原位過濾策略實現了石墨烯量子點的高產率制備和簡易分離。通過使用限域的納米反應器，所獲得的石墨烯量子點粒徑均一、分散性好，解決了自上而下法合成n-gqds分離困難、產率低和尺寸難以控制等難題。研究表明，石墨烯量子點富含羥基和羧基等含氧官能團不僅使其具有極佳的水溶性，而且以fe³⁺為熒光淬滅劑形成fe³⁺-n-gqds體系，加入生物小分子aa作為還原劑，實現對aa的turn-on檢測，并實施了魚血中aa的檢測，獲得令人滿意的回收率。

本發明以有序介孔二氧化硅為模板，所述有序介孔二氧化硅按照以下方法制備：

將正硅酸乙酯、三嵌段共聚物p123、水和濃鹽酸混合均勻，100～130℃條件下反應20～28h，將得到的產品洗滌、干燥后在空氣條件下，500～580℃退火4～8h，得到有序介孔二氧化硅。

其具體操作步驟如下：

將正硅酸乙酯、三嵌段共聚物p123、水和濃鹽酸混合均勻。將此溶液轉移至高壓反應釜中，100～130℃條件下反應20～28h。反應結束后，用大量的超純水和乙醇洗滌并過濾，所得產品在50～60℃下干燥。最終，將烘干后的產品在空氣條件下，500～580℃退火4～8h，得到有序介孔二氧化硅sba-15。

其中，三嵌段共聚物p123的重均分子量(mw)為3000～10000，優選為4000～6000，更優選為5800。

獲得有序介孔二氧化硅模板后，將碳氮源、三甲基苯、硫酸和乙醇混合后注入有序介孔二氧化硅中，在60～100℃下加熱2～8h，再在120～180℃下反應3～10h，然后在700～1000℃氮氣氣氛下加熱1～5h，得到碳/氮/二氧化硅納米復合物；其中，所述碳氮源為吡咯或喹啉。其中，有序介孔sio2(sba-15)為模板，喹啉或吡咯作為碳氮源，三甲基苯作為擴孔劑、硫酸作為催化劑，反應后得到聚喹啉/sio2或聚吡咯/sio2，然后在700～1000℃氮氣氣氛下加熱1～5h，得到碳/氮/二氧化硅納米復合物。

其中，所述碳氮源、三甲基苯、硫酸和乙醇的摩爾比為1：2～7：1～4：0.1～0.6。

得到碳/氮/二氧化硅納米復合物后，將其在濃硝酸蒸汽中反應，利用簡易的硝酸蒸氣切斷策略，在密閉反應釜的空間內，氧化切斷有序介孔n/c/sio2孔壁表面的含氮碳層，獲得氮摻雜石墨烯量子點(n-gqds)。

具體而言，所述步驟b具體為：

將碳/氮/二氧化硅納米復合物放入玻璃器皿中，將所述玻璃器皿放入含有濃硝酸的反應釜中，120～160℃加熱1～3h，將玻璃器皿原位過濾，得到氮摻雜石墨烯量子點溶液。

首先，將制備好的碳/氮/二氧化硅納米復合物放入玻璃器皿中。其次，將玻璃器皿放入含有濃硝酸的反應釜中。再次，將此反應釜放入120～160℃烘箱中加熱1～3h。最后，將反應后的玻璃器皿原位過濾，收集黃色濾液，為n-gqds溶液。

此外，本發明還包括：將過濾后的沉淀在空氣條件下，520～580℃退火3～6h，回收有序介孔二氧化硅。

得到氮摻雜石墨烯量子點溶液后，將0.15～0.3mln-gqds溶液用1.6～2ml超純水(≥18.2mω)稀釋，然后以20nm為間隔的激發波長激發n-gqds，狹縫為5～10nm進行熒光測試。實驗結果表明，激發波長是340nm時，它的熒光發射峰強度最大。因此，我們選擇340nm為激發波長用于以下熒光實驗。

取制備的n-gqds溶液和超純水于石英比色皿中，首先加入fe³⁺溶液，得到測試體系，測定不同aa濃度下的熒光強度，以熒光強度對aa濃度繪制傳感曲線圖，然后用于檢測抗壞血酸。

本發明還提供了一種抗壞血酸的檢測方法，包括：

按照上述技術方案所述的制備方法制備氮摻雜石墨烯量子點溶液；

將所述氮摻雜石墨烯量子點溶液與fe³⁺溶液混合，得到fe³⁺-n-gqds混合液；

向所述fe³⁺-n-gqds混合液中加入待測物，測定得到的溶液的熒光強度，根據預定的標準曲線計算待測物中抗壞血酸的含量。

其中，所述預定的標準曲線按照以下方法得到：

按照上述技術方案所述的制備方法制備氮摻雜石墨烯量子點溶液；

將所述氮摻雜石墨烯量子點溶液與fe³⁺溶液混合，得到fe³⁺-n-gqds混合液；

向所述fe³⁺-n-gqds混合液中加入系列濃度的抗壞血酸溶液，測定得到的溶液的熒光強度，建立恢復的熒光強度比f/f0與濃度的工作曲線，其中，f為加入抗壞血酸溶液后的熒光強度，f0為未加入抗壞血酸溶液時的熒光強度。

本發明利用納米反應器限域n-gqds的制備方法并利用n-gqds的熒光“開關”模式專一性檢測aa，是基于選用有序介孔sio2作為納米反應器，在其孔壁表面覆蓋納米級厚度且可調的含氮石墨烯層，獲得有序介孔n/c/sio2復合物，利用酸蒸汽氧化切斷策略及介孔限域作用，制備粒徑、層數可控的n-gqds。n-gqds表面的富氧官能團特別是酚羥基和羧基是其對fe³⁺具有較好選擇性的主要因素。此外，n-gqds表面的羧基對fe³⁺也具有較大的貢獻。基于以上分析，當fe³⁺加入到n-gqds溶液之后形成了fe-n-gqds配合物，這個配合物利于光生電子從n-gqds到fe³⁺的轉移，從而淬滅熒光，加入aa后，利用fe³⁺作為氧化劑，通過加入具有還原作用及配位作用的aa改變氮摻雜石墨烯量子點的配位環境，進而恢復n-gqds的熒光發射，達到turn-on檢測aa的目的。實驗結果表明，本發明提供的方法制備得到的n-gqds粒徑尺寸均一，分布較窄，直徑在1.7～3.9nm范圍之間；分散性良好，均勻分散排布，高度小于2.0nm，說明所合成的n-gqds由1-5層石墨烯構成；由大量的c、o及微量的n元素構成，具有較好的水溶性。以該量子點作為熒光探針對抗壞血酸具有良好的選擇性，且對抗壞血酸的檢測具有良好的準確度。

附圖說明

圖1為本發明中使用的玻璃器皿。

圖2為本發明實施例2制備的n-gqds的透射電鏡圖。

圖3為本發明實施例2制備的n-gqds的原子力顯微鏡圖(a)及高度圖(b)。

圖4為本發明實施例2制備的n-gqds的xps譜圖。

圖5為本發明實施例3fe³⁺-n-gqds對aa的傳感應用圖，不同濃度aa下的fe³⁺-n-gqds溶液的熒光光譜圖(aa濃度從上到下依次是：0,10，20，30，40，50，60，70，80，90和100μm)。

圖6為本發明實施例3fe³⁺-n-gqds對aa檢測的工作曲線，f0和f分別是340nm激發下，aa缺乏和存在下的熒光強度。

圖7為本發明實施例3fe³⁺-n-gqds在50μm不同生物小分子存在下的淬滅性能，從左到右分別為：尿酸(aa)、果糖(fru)、葡萄糖(glc)、乙醇(et)、l-半胱氨酸(cys)、l-谷氨酸(l-gla)、l-亮氨酸(l-leu)和l-苯丙氨酸(l-phe)。

具體實施方式

實施例1有序介孔的含氮高分子/sio2復合材料的制備

將正硅酸乙酯、三嵌段共聚物p123(mw＝5800)、水和濃鹽酸混合均勻。將此溶液轉移至高壓反應釜中，110℃條件下反應24h。反應結束后，用大量的超純水和乙醇洗滌并過濾，所得產品在60℃下干燥。最終，將烘干后的產品在空氣條件下，550℃退火6h，得到有序介孔二氧化硅sba-15。

取摩爾比為1：5：3：0.4的吡咯、三甲基苯、硫酸和乙醇混合溶液孕注到sba-15中，先在80℃烘箱中加熱6h，隨后在160℃烘箱中反應8h，然后所得樣品在800℃氮氣氣氛下加熱4h，得到碳/氮/二氧化硅納米復合物。

實施例2氮摻雜石墨烯量子點的制備

將實施例1制備好的碳/氮/二氧化硅納米復合物放入如圖1所示的玻璃器皿中，然后放入含有濃硝酸的反應釜中，再將此反應釜放入120～160℃烘箱中加1～3h。最后，將反應后的玻璃器皿原位過濾，收集黃色濾液，為n-gqds溶液。

對所述n-gqds溶液進行檢測，結果參見圖2、圖3和圖4，圖2為本發明實施例2制備的n-gqds的透射電鏡圖；圖3為本發明實施例2制備的n-gqds的原子力顯微鏡圖及高度圖；圖4為本發明實施例2制備的n-gqds的xps譜圖。

由圖2可見n-gqds粒徑尺寸均一，分布較窄，直徑在1.7～3.9nm范圍之間。通過統計分析100個量子點的尺寸，該量子點的平均粒徑約為2.5nm。

從圖3中n-gqds的afm圖中可看出，n-gqds分散性良好，均勻分散排布，與它的tem結果吻合。所獲得的n-gqds高度小于2.0nm，說明所合成的n-gqds由1-5層石墨烯構成。

圖4中n-gqds的xps全譜圖顯示了一個弱的n1s(405ev)的特征峰和兩個明顯的c1s(284ev)和o1s(532ev)的特征峰，表明該量子點由大量的c、o及微量的n元素構成，其中氮含量和氧含量分別約為5.304％和32.509％。n-gqds高的氧含量使其具有較好的水溶性，為其應用提供了可能。

實施例3aa的檢測

將0.15～0.3ml實施例2制備的n-gqds溶液用1.6～2ml超純水(≥18.2mω)稀釋，然后以20nm為間隔的激發波長激發n-gqds，狹縫為5～10nm進行熒光測試。實驗結果表明，激發波長是340nm時，它的熒光發射峰強度最大。因此，我們選擇340nm為激發波長用于以下熒光實驗。

將實施例2制備的n-gqds過濾液用超純水(≥18.2mω)稀釋獲得檢測液。然后加入50μm的fe³⁺溶液，形成fe³⁺-n-gqds檢測平臺，然后加入aa，測定不同aa濃度下的熒光強度，而恢復的熒光強度比f/f0與加入的aa量成線性關系，繪制標準曲線。

結果參見圖5和圖6，圖5為本發明實施例3fe³⁺-n-gqds對aa的傳感應用圖，不同濃度aa下的fe³⁺-n-gqds溶液的熒光光譜圖(aa濃度從上到下依次是：0,10，20，30，40，50，60，70，80，90和100μm)；圖6為本發明實施例3fe³⁺-n-gqds對aa檢測的工作曲線，f0和f分別是340nm激發下，aa缺乏和存在下的熒光強度。

圖5和6表明隨著aa濃度的增加，淬滅的n-gqds熒光逐漸恢復，且恢復的熒光強度比f/f0在0.5-40μm范圍內成一定的線性關系。線性方程為f/f0＝1.04461+0.05575*caa(r＝0.993)，式中f為加入aa后的熒光強度，f0為未加入aa時的熒光強度。本發明的傳感器對aa的線性范圍較寬，展現了其優勢。

實施例4fe³⁺-n-gqds對aa的選擇性測試及n-gqds的光穩定性測試

將fe³⁺-n-gqds檢測液放入石英比色皿中，然后分別加入50μm的干擾物質多巴胺、尿酸、葡萄糖、果糖、乙醇、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-亮氨酸和l-苯丙氨酸。結果參見圖7，圖7為本發明實施例3fe³⁺-n-gqds在50μm不同生物小分子存在下的淬滅性能，從左到右分別為：尿酸(aa)、果糖(fru)、葡萄糖(glc)、乙醇(et)、l-半胱氨酸(cys)、l-谷氨酸(l-gla)、l-亮氨酸(l-leu)和l-苯丙氨酸(l-phe)。

由圖7可知，相比于以上干擾物質極小的熒光增強，當50μmaa加入到fe³⁺-n-gqds后，熒光增強為原來的4.89倍。這些結果表明所制備的fe³⁺-n-gqds對aa具有好的選擇性。

實施例5檢測魚血中的aa

水樣取自魚血漿，用其配制已知濃度的aa標準溶液。將fe³⁺-n-gqds檢測液放入石英比色皿中。然后分別加入10，30，40μm的fe³⁺，測定熒光強度，利用工作曲線計算aa的含量。利用本發明的熒光傳感器檢測到的aa的濃度為9.53μm,30.45μm，42.48μm，aa的回收率各是95.3±0.5％，101.5±1.0％和106.2±0.8％(表1)：

表1

從表1中可以看出：本發明所述的n-gqds可以應用于魚血中aa的檢測，且具有較高的準確度。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。