一種高熒光氮摻雜碳量子點、其制備方法及應用與流程

本發明屬于碳納米材料領域，具體涉及一種高熒光氮摻雜碳量子點，同時還涉及該高熒光氮摻雜碳量子點的制備方法，及該高熒光氮摻雜碳量子點在生物成像中的應用。

背景技術：

重金屬量子點因其出色的發光性能被廣泛的研究，然而，他們大部分具有較高的毒性和較高的生產成本。探究生物相容性好、優良光致發光性能、低毒，較小粒徑的熒光材料，并滿足生物成像、藥物運輸、熒光油墨等應用，具有較大潛在應用價值。熒光碳量子點由生物相容性優異的碳元素作為核心組件，量子點材料因其納米大小又常表現出宏觀尺寸材料所不具備的特異性能，并具有良好的光學性能，高亮度和小尺寸是碳量子點最具吸引力的兩個優點，因而吸引了科學家極大的關注。因碳量子點的平均尺寸小于10nm，易進入細胞或動物體后仍保持熒光性能，可用為熒光探針跟蹤生物大分子或生物反應過程。因此，熒光碳量子點具有廣泛的應用前景，包括生物傳感、成像、光催化、藥物運輸和熒光油墨等領域。

目前，研究者建立了多種制備熒光碳量子點的方法：激光刻蝕法、電弧放電法、化學氧化法、電化學法、超聲處理、微波輻射法和水熱法。其中，水熱法被認為是一種簡單、高效制備熒光碳量子點的方法，它是將所選碳源置于密閉的水熱反應釜中，高溫下水熱反應釜內會產生高壓環境,使碳源發生碳化形成碳量子點，水熱法具有成本低、產率高、后處理簡單等優勢，目前己廣泛應用于碳量子點制備領域，但其碳量子點的熒光活性位點少、產率低(大部分小于15％)、選擇性等成為發展的瓶頸。近年來，通過異原子摻雜等方法來克服，提高其產率及增加活性位點，其中采用氮摻雜是目前研究最多的方法，但普遍存在氮摻雜熒光效率不高，制備復雜。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服上述缺點而提供的一種熒光效率高，制備簡單，低毒、良好的生物相容性及水溶性、粒徑小的高熒光氮摻雜碳量子點。

本發明的另一目的在于提供該高熒光氮摻雜碳量子點的制備方法。

本發明的再一目的在于提供該高熒光氮摻雜碳量子點在豆芽和宮頸癌細胞成像中的應用。

本發明的一種高熒光氮摻雜碳量子點，其氮的含量可達15.5～19.2％，平均熒光壽命為4.41～4.51ns，熒光量子產率最高可達20.3～32.9％。

本發明的一種高熒光氮摻雜碳量子點的制備方法，包括以下步驟：

(1)將l-瓜氨酸溶解于去離子水中使其濃度為0.010～0.040g/ml，超聲震蕩5～20min，再采用水熱法在180～220℃反應8～24h獲取碳點溶液；

(2)將碳點溶液在17000～20000r/min超速離心20～40min，再用0.22μm濾膜過濾，獲得碳點溶液。

本發明的高熒光氮摻雜碳量子點在豆芽和宮頸癌細胞中的應用。

本發明與現有技術相比，具有明顯的有益效果，從以上技術方案可知：本發明采用前驅體l-瓜氨酸為碳源，采用一步水熱法制備氮摻雜的碳量子點，本發明具有低細胞毒性和良好的生物相容性及水溶性，低毒，粒徑小等特點。適用于體內外熒光成像、藥物運輸、熒光油墨等領域。與其他含氮有機物為碳源合成的碳量子點相比，本發明制備的氮摻雜的碳量子點中氮的含量為15.5～19.2％，平均熒光壽命為4.46ns，熒光量子產率最高可達32.9％，且具有低細胞毒性和良好的生物相容性，在豆芽和宮頸癌細胞生物成像中具有廣泛的應用價值。

附圖說明

圖1本發明的氮摻雜碳量子點的紅外表征。

圖2本發明的氮摻雜熒光碳量子點的光電子能譜圖，其中(a)是全譜圖，(b)是碳元素的分峰圖，(c)是氮元素的分峰圖，(d)是氧元素的分峰圖。

圖3本發明的氮摻雜熒光碳量子點的熒光壽命圖。

圖4本發明的的氮摻雜碳量子點在不同激發波長下對應的發射光譜圖。

圖5本發明的氮摻雜碳量子點的掃描電鏡(a)和透射電鏡(b)圖。

圖6本發明的氮摻雜熒光碳量子點的原子力顯微鏡表征圖。

圖7本發明的氮摻雜碳量子點的粒徑分布圖。

圖8本發明的氮摻雜熒光碳量子點的熒光量子產率測試數據圖。

圖9本發明的氮摻雜熒光碳量子點的ph穩定性測試數據圖。

圖10本發明的氮摻雜熒光碳量子點的細胞毒理實驗結果圖。

圖11本發明的氮摻雜的熒光碳量子點在豆芽中的應用。

圖12本發明的氮摻雜的熒光碳量子點在宮頸癌細胞(hela)中的應用。

具體實施方式

實施例1

一種高熒光氮摻雜碳量子點的制備方法，包括以下步驟：

(1)將l-瓜氨酸溶解于去離子水中使其濃度為0.010g/ml，超聲震蕩5min，再采用水熱法在180℃反應8h獲取碳點溶液；

(2)將碳點溶液在17000r/min超速離心20min，再用0.22μm濾膜過濾，獲得氮含量為15.5％，平均熒光壽命為4.41ns，熒光量子產率為20.3％的碳點溶液。

實施例2

一種高熒光氮摻雜碳量子點的制備方法，包括以下步驟：

(1)將l-瓜氨酸溶解于去離子水中使其濃度為0.020g/ml，超聲震蕩10min，再采用水熱法在200℃反應12h獲取碳點溶液；

(2)將碳點溶液在18000r/min超速離心20min，再用0.22μm濾膜過濾，獲得氮含量為19.2％，平均熒光壽命為4.46ns，熒光量子產率為32.9％的的碳點溶液。

實施例3

一種高熒光氮摻雜碳量子點的制備方法，包括以下步驟：

(1)將l-瓜氨酸溶解于去離子水中使其濃度為0.040g/ml，超聲震蕩20min，再采用水熱法在220℃反應24h獲取碳點溶液；

(2)將碳點溶液在20000r/min超速離心40min，再用0.22μm濾膜過濾，獲得氮含量為18.6％，平均熒光壽命為4.51ns，熒光量子產率為28.3％的的碳點溶液。

試驗例1

將實施例2中制備的碳點采用紅外和光電子能譜對其表面官能團及結構進行表征；熒光壽命、熒光發射光譜是對其光致發光性能進行表征；原子力顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡是對其粒徑大小、高度等表面形貌特征進行表征；實驗結果如下：

圖1紅外光譜圖，3433cm^-1為–nh伸縮振動峰；1625cm^-1處為c＝o伸縮振動峰；1408cm^-1為c-o的伸縮振動峰；674cm^-1為c-h的面外彎曲震動吸收峰。圖2光電子能譜及分峰圖，284.78、400.48、530.38ev分別對應圖中的c1s、n1s、o1s吸收峰，且碳點中c、n、o的原子含量分別為54.5％、19.2％、26.3％，再對c1s、n1s、o1s吸收峰進行分峰，c1s：284.38、284.48、285.38、287.38ev分別對應的為c-c、c-n、c-o、c＝o鍵；n1s：398.98、400.28、400.68ev分別對應的為n-h、c-n、c-n-c鍵；o1s：530.38、531.38ev分別對應的為c＝o、c-oh鍵。綜合紅外和光電子能譜及原材料的分子結構，可以確定存在–oh、coo-、-nh2這些官能團。通過儀器測量，碳點的平均熒光壽命為見圖3。圖4為其熒光發射光譜，考查了320～600nm的激發波長，在激發波長為360nm條件下，碳點的熒光強度達到最大值。圖5和圖6分別為掃描電鏡、透射電鏡圖和原子力顯微鏡圖，經形貌測量，實施例2氮摻雜碳量子點的平均高度和粒徑大約為2nm，近乎微觀準球形的碳納米材料，且碳點的粒徑分布符合正態分布(圖7)。

試驗例2

測量熒光量子產率：選取硫酸奎寧(qy＝54.0％)為標準物，在相同的激發波長下(350nm)，獲得吸光度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05的標樣和待測樣溶液，分別測其熒光強度，分別獲得標準物和實施例2樣品的標準曲線方程，如圖8所示，分別將圖中標準物和實施例2樣品的標準曲線方程的斜率帶入下列方程：

qyx＝qyst(gx/gst)(ηx/ηst)²

qyx和qyst:樣品和標準物的熒光量子產率；

gx和gst:樣品和標準物標準曲線方程的斜率；

ηx和ηst：樣品和標準物溶液所用溶劑的折射率；

經計算，獲得了較高熒光量子產率的碳量子點，為32.9％。

試驗例3

將實施例1、實施例2和實施例3制備的碳點進行氮摻雜熒光碳量子點的ph穩定性測試：調節ph所用的試劑為naoh和hcl稀溶液，取2.0ml濃度為4mg/ml的碳點溶液，用naoh和hcl調節ph，分別為1、3、5、7、9、11、13，溶液定容至20ml，實驗結果如圖9所示，在ph為5～9的范圍內，碳點溶液展示了良好的熒光穩定性，證明其適用于體外成像。

試驗例4

將實施例1、實施例2和實施例3制備的碳點進行mtt比色法毒性測試，步驟如下：(1)將細胞在5％co2，37℃孵育24h，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，在每孔加入待測溶液，使待測溶液在每孔的濃度梯度分別為0、20、100、300、500、1000μg/ml^-1；(2)24h過后，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，繼續培養4h；(3)終止培養，小心吸去孔內培養液；(4)每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光值。

從圖10實驗結果可知，隨著濃度的增加和培養時間的延長，細胞的存活率雖有所下降，但在濃度1000μgml^-1培養48h的條件下，細胞存活率為80％，證明本發明的氮摻雜的碳量子點基本適合于活體細胞成像的研究。

試驗例5

將實施例2中制備的氮摻雜的熒光碳量子點在豆芽中進行應用。將準備好的黃豆浸泡在水中2h，待黃豆吸水至飽滿時放入塑料制籃子里培養，每天分早中晚給黃豆澆水至表面濕潤，待黃豆芽長至約2cm長時轉入濃度為4mg/l的樣品溶液中培養約6h(2cm長豆芽浸沒溶液中約1cm)。培養結束后取出豆芽，用去離子水清洗三次，將豆芽放在紫外燈下觀察其熒光標記情況。如圖11所示，在365nm的紫外燈照射下，黃豆芽的胚根上發出了藍色熒光，取得了較好的熒光標記效果。

試驗例6

將實施例2中制備的氮摻雜的熒光碳量子點在宮頸癌細胞(hela)中進行應用。在細胞培養基中加入100μg·ml^-1碳點溶液，將培養基放在培養箱中培養4h。取出，后用磷酸緩沖溶液清洗三次，分別在405nm、488nm的激發波長下進行激光共聚焦成像。如圖12所示，細胞的熒光標記效果較好，本實驗的碳點在癌細胞中的熒光標記取得了較好的效果，為下一步的實驗做好一個良好的鋪墊。

本發明并不局限于上述實施方式，如果對本發明的各種改動或變形不脫離本發明的精神和范圍，倘若這些改動和變形屬于本發明的權利要求和等同技術范圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變形。