一種阿樸菲類生物堿的應用的制作方法
本發明屬于化工技術領域，具體涉及一種 阿樸菲類生物堿的應用。
背景技術：
隨著人類海洋活動的增加，海洋污損生物的危害越來越受到人類的重視。海洋污損生物是附著生殖在船底、水下管道、石油平臺、漁業的網具及其他一切海中人為設施表面的有害生物，主要分為三大類：菌類、附著植物和附著動物。其代表性的品種有細菌、真菌（菌類）、絲藻、硅藻、滸苔、石莼(植物類)、藤壺、貽貝、石灰蟲、海鞘、牡蠣、苔蘚蟲、花筒螅(動物類)等，對船舶影響最大的是絲藻、滸苔、藤壺、石灰蟲、苔蘚蟲、海鞘等。海洋污損生物一旦在海洋設施表面附著將產生嚴重的危害，如增加船艦航行的阻力；使海水冷卻管道和熱交換器的冷凝管管徑縮小，甚至完全堵塞；促進腐蝕和導致隙縫腐蝕；使海中的儀表和機械失靈；吸收聲能，使聲學儀器減效或失效；增加海中建筑物樁、柱的截面積，加大波浪和海流的沖擊力；堵塞網孔；與養殖的貝、藻類爭奪附著基和餌料等。海洋污損生物帶來的危害給海洋運輸、水產養殖等行業造成巨大的經濟損失。
目前污損生物的防除主要通過物理措施、化學手段及生物學方法，或通過上述幾類方法協同作用來實現防污損的目的。化學手段具體可分為藥物浸泡法、涂料涂層保護法、電解防污法和直接毒殺法等。其中涂裝防污涂料的方法是目前運用最為廣泛的方法，且操作簡便，防污效果持久，被認為是最有效的方法。氧化亞銅是目前應用最為廣泛的一種海洋防污劑，它對絕大多數的動物類海生物和多數的植物類海生物具有防污活性，但對軟污損海生物防污效果不佳，需要添加輔助防污劑來達到全面的防污效果。銅元素也具有毒害作用，其會在海洋中，尤其是海港中大量積聚，導致海藻大量死亡。天然生物制劑通常有較好的環境可接受性，多數可以自然分解，不會產生永久性的生物積累，并且來源廣泛。從天然產物中有望獲得低毒、高效、廣譜的海洋活性防污劑，從而替代對環境有毒的防污劑。目前已從海洋和陸地生物中發現了許多具有抗污損活性的物質，包括萜類、炔類、多環化合物、甾族化合物、異硫氰酸鹽等類型的物質。但也還遠遠不能滿足市場的實際需求，因此，開發一種能解決防污損的產品是非常必要的。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種阿樸菲類生物堿的應用。
本發明的目的是這樣實現的，所述的阿樸菲類生物堿在制備防污涂料中的應用。
本發明的目的是針對防海洋生物污損現有技術的不足和海洋防污涂料存在的使用困難、有效率低和毒性所造成的污染等問題，提供從天然產物蓮葉桐科中的青藤屬植物心葉青藤中分離鑒定出3種無毒且具有顯著抗污損活性的阿樸啡類生物堿。為解決現有技術中存在的上述問題，本發明提供阿樸啡類生物堿在防止海洋生物污損中的用途、用于防止海洋生物污損的防污涂料及其制備方法以及用于防止水下結構表面受到海洋生物的附著和/或污損的方法。
本發明具有以下有益效果：
1. 本發明中的阿樸啡類生物堿可為天然存在的有機化合物，并且為無毒化合物，不含有毒重金屬，在海洋環境中易降解，不會造成水體環境的污染，不會通過食物鏈傳遞導致其在生物體中的富集，對環境友好，安全性高。
2. 本發明中的阿樸啡類生物堿展現出較強的抑制生物污損活性，可為抗污損涂料或其它抗污損產品的開發提供有價值的先導化合物，有著很好的應用前景。
3. 本發明中的阿樸啡類生物堿是天然產物，但其人工合成工藝成熟，獲取途徑簡便，適合于大規模生產，不受限于生物體內的含量，具有可靠穩定的來源，推廣應用潛力大。
4. 本發明提供的抗生物污損物質，是通過生物測試指導的化學分離方法，從心葉青藤中分離鑒定出來的，或者是利用構效關系分析結果從其它來源的化合物中篩選而來，實驗證明本發明所涉及的化合物是天然無毒的抗生物污損化合物。利用所述無毒化合物所制成的抗生物污損涂料對環境是無害的。
附圖說明
圖1為本發明中所述的3種抗生物污損活性阿樸啡類生物堿的活性追蹤分離流程圖；
圖2為左旋黃肉楠堿對紋藤壺(Balanus amphitrite)幼蟲附著的抑制作用的圖。圖中所示為至少3個重復樣平均值和標準方差；
圖3為蓮葉桐堿對紋藤壺(Balanus amphitrite)幼蟲附著的抑制作用的圖。圖中所示為至少3個重復樣平均值和標準方差；
圖4為右旋黃肉楠堿對紋藤壺(Balanus amphitrite)幼蟲附著的抑制作用的圖。圖中所示為至少3個重復樣平均值和標準方差。
具體實施方式
下面結合實施例和附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發明的保護范圍。
所述的阿樸菲類生物堿的應用為所述的阿樸菲類生物堿在制備防污涂料中的應用。
所述的防污涂料為防止水下結構表面受到海洋生物的附著和/或污損的防污涂料。
所述的海洋生物為藤壺類生物。
所述的阿樸菲類生物堿具有以下結構：
其中，R1，R2，R3為H、OH或OCH3。
所述的阿樸菲類生物堿為、和中的一種或幾種。
本發明所述的防污涂料為所述的防污涂料是以所述的阿樸菲類生物堿的應用中的阿樸菲類生物堿作為抗污損活性成分制備得到的防污涂料。
所述的防污涂料是以阿樸菲類生物堿作為抗污損活性成分與成膜成分混合制成用于防止水下結構表面收到海洋生物的附著和/或污損的防污涂料。
所述的成膜成分為可水解、可溶或不可溶樹脂中的一種或幾種。
所述的成膜成分為醇酸樹脂、丙烯酸樹脂、氯化橡膠樹脂、環氧樹脂、硅氧烷樹脂、聚酯、聚氨酯和含氟聚合物中的一種或幾種。
所述的抗污性活性成分加入量為成膜成分重量百分比的0.1~20%。
本發明中的阿樸啡類生物堿可以是天然存在的化合物，也可以是人工合成的化合物。
本發明中的“防污涂料”的種類可以是本領域已知的用于防止海洋生物污損的防污涂料，例如：可溶性本體涂料、自拋光共聚物類涂料、非黏合型涂料、低表面能防污涂料、黏合劑型涂料、仿生涂料及天然防污劑涂料等（可參見科技文獻：張東輝等，“防污涂料綜述”，現代涂料與涂裝，第10卷第5期，2007年），只要其中含有成膜成分以及本發明中所述抗污損成分即可。
對本發明中的成膜成分與抗污損成分的比例沒有特別限定，只要抗污損成分的含量為有效量即可。例如，抗污損成分的加入量可以是成膜成分的重量的0.1%~20%，優選地是1%~15%。
在本發明中涉及的術語“有效量”即在特定環境中達到抗污損效果的活性成分的量。
本發明中所述成膜成分可以為本領域已知的用于防止海洋生物污損的防污涂料中的成膜成分，并且可以為可水解、可溶或不溶性樹脂中的一種或幾種；例如，可以為醇酸樹脂、丙烯酸樹脂、氯化橡膠樹脂、環氧樹脂、硅氧烷樹脂、聚酯、聚氨酯和含氟聚合物等。
本發明所述的阿樸菲類生物堿優選從蓮葉桐科中的青藤屬植物（如心葉青藤）中分離得到的阿樸啡類生物堿。
該屬植物全世界約有30種，分布于東半球熱帶，亞熱帶地區。我國境內共有14種1亞種6變種，分布于云南、四川、貴州、廣西、廣東、湖南、福建及臺灣等省區。該屬植物具有消腫解熱，驅風除濕，散瘀止痛及治療跌打損傷等作用。
發明人發現青藤屬植物（如心葉青藤）的溶劑（如90體積%的乙醇/水）提取物具有較好的抗生物污損活性，并在生物活性測試指導下對提取物進行化學成分研究，從中獲得了抗生物污損活性較好的阿樸啡類生物堿成分。來自心葉青藤的生物堿類化合物的結構由阿樸啡類生物堿的母體結構組成，其它區別只是取代基及取代基的位置不同而已。
(1) 阿樸啡類生物堿的母體結構如下：
(2) 所述化合物可以用以下結構式表示：
其中，R1，R2，R3為H、OH或OCH3。
所述阿樸啡類生物堿主要來自心葉青藤，包括（但不限于）：左旋黃肉楠堿，蓮葉桐堿及右旋黃肉楠堿。
左旋黃肉楠堿((-)-actinodaphine)的結構式為：
蓮葉桐堿(nandigerine),的結構式為：
右旋黃肉楠堿 ((+)-actinodaphine)的結構式為：
本發明所述的阿樸啡類生物堿所抑制的海洋生物為（但不限于）藤壺類生物。優選地是，所述阿樸啡類生物堿可以抑制藤壺類生物的附著。所述阿樸啡類生物堿優選抑制藤壺類生物的幼蟲附著。
本發明人計算了左旋黃肉楠堿，蓮葉桐堿及右旋黃肉楠堿的半數抑制附著濃度。計算結果表明3種化合物對紋藤壺幼體的半數抑制附著濃度 EC50測定結果分別為3.62 ± 0.7 μg/mL、3.42 ± 0.5 μg/mL及3.80 ± 0.9 μg/mL，上述結果表明3種化合物都顯示出較好的抗生物污損活性，并且3種化合物的抗污損活性比較接近。此外，根據AVIelin等（參見科技文獻：Mary A., Mary VI., Rittschof D., Nagabhushanam R. Bacterial-barnacle interaction: potential of using juncellins and antibiotics to alter structure of bacterial communities. J Chem. Ecol. 1993,19(10):2155-2167.），毒效比（LC50/ EC50）大于10以上的抗生物污損化合物為無毒抗生物污損化合物。經測試上述3種化合物的毒效比都大于10，表明這3種化合物均為無毒抗生物污損化合物。
本發明還提供上述阿樸啡類生物堿的制備方法。該方法包括從青藤屬植物（如心葉青藤）中制備所述化合物。優選的是，從心葉青藤植物的根、莖、葉、果實中制備阿樸啡類生物堿。優選的是，所述方法具有下述步驟：
（1）將干燥的心葉青藤的根粉碎，得心葉青藤的根碎塊；
（2）將心葉青藤根的碎塊用溶劑浸泡，得提取液；
（3）將提取液過濾、減壓濃縮得浸膏；
（4）將浸膏分散在水中，依次用石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇進行萃取，萃取液減壓蒸餾后，分別得石油醚萃取部分浸膏、乙酸乙酯萃取部分浸膏、正丁醇萃取部分浸膏；
（5）取乙酸乙酯萃取部分浸膏經硅膠柱色譜，用氯仿-甲醇(體積比1:0～2:1)梯度洗脫得到13個組分(Fr.1～Fr.13)。
（6）Fr.7經硅膠柱層析，用二氯甲烷：甲醇 (體積比30:1~0:1)梯度洗脫得到組分Fr.7a~7d。Fr.7c經硅膠柱層析，用二氯甲烷：甲醇 (體積比15:1)洗脫得到Fr.7c-1~6。Fr.7c-2以甲醇：水(體積比30:70)為流動相，經HPLC制備得到化合物1；Fr.7c-4以甲醇：水(體積比25: 75)為流動相，經HPLC制備得到化合物2；Fr.8經硅膠柱層析，用二氯甲烷：甲醇(體積比30:1~0:1)梯度洗脫得到組分Fr.8a~8h。Fr.8b經硅膠柱層析，用二氯甲烷：甲醇(體積比20:1)洗脫得到組分Fr.8b-1~5。Fr.8b-2以甲醇：水(體積比61：39)為流動相，經HPLC制備得到化合物3。
在步驟（2）中，所述的溶劑可用體積百分比為70%~95%的乙醇/水、或70%~90%的甲醇/水、或50%~70%的丙酮/水，回流提取時間為每次2小時，回流提取最好重復3次。
本發明還提供制備防污涂料的方法，包括以下步驟：1）提供抗污損成分；以及2）將步驟1）得到的抗污損成分與成膜成分混合，得到防污涂料。其中在所述步驟1）中，抗污損成分可以是式I所示的化合物，也可以這樣得到：用上述溶劑提取心葉青藤植物得到提取液；將所得提取液經過濾、減壓濃縮，制成浸膏，以作為所述抗污損成分；還可以將所得浸膏通過上述柱層析法進一步分離純化，得到所述阿樸啡類生物堿以作為所述抗污損成分。
本發明還提供所述阿樸啡類生物堿在制備用于防止海洋生物污損的涂料中的用途。本發明所述的具有抗污損活性的化合物具有防污作用，因此可將所述的具有抗污損活性的化合物用于制備高效的防污劑。
本發明還提供一種用于防止海洋生物污損的方法，其包括：在水下結構表面涂覆本發明的防污涂料。
本文中所述“水下結構”包括（但不限于）：排水管、船體水下部分、螺旋槳、養魚網箱、碼頭及海洋石油平臺的水下結構、水雷、浮標、海底電纜、臨海發電廠冷卻管道等。
下面以具體實施案例對本發明做進一步說明：
實施例1 心葉青藤植物提取物對紋藤壺幼蟲附著的抑制活性
材料來源：心葉青藤采于云南祿勸，經中國科學院昆明植物研究所陶德定研究員鑒定為Uraria clarkei(Clarke) Gagnep.，標本保存于云南民族大學民族醫藥學院標本館。
心葉青藤提取物的制備：將干燥的心葉青藤根粉碎，分別得心葉青藤的根碎塊；然后將心葉青藤根的碎塊用體積90 %乙醇回流提取3次，每次2小時得提取液；將心葉青藤提取液分別過濾并用旋轉蒸發儀減壓濃縮成浸膏備用。
采用抑制紋藤壺金星幼蟲附著的實驗模型（可參見科技文獻：Xu Y., He H. P., Qian P. Y, et al. Potent antifouling compounds produced by marine streptomyces. Bioresource Technology. 2010,101(4):1331-1336）測試了青藤屬植物心葉青藤的提取物抑制藤壺幼蟲附著的能力。采用24孔培養板測定在50 μg/mL和10 μg/mL的濃度下心葉青藤提取物的抗幼蟲附著活性。紋藤壺成蟲（Darwin）采自香港(22° 19'N，114°16'E)潮間帶。在12 L的聚苯乙烯塑料培養容器中放入8 L過濾的海水，然后將紋藤壺成蟲放入容器中，放置讓其釋放幼蟲，2.5 h后收集幼蟲，該階段的幼蟲稱為無節幼蟲(nauplius)，沒有附著能力。將無節幼蟲放入裝有8 L過濾海水(濾膜孔徑為0.22 μm)的容器中，在24℃溫度和15 h亮:9 h暗的光照周期下通氣培養，并喂食角毛硅藻(Chaetoceros gracilis Schutt)，培養3天以后收集幼蟲備用，該階段的幼蟲稱為金星幼蟲(cypris)，有附著能力。將心葉青藤的提取物與二甲亞砜(DMSO)混合，然后用無菌過濾海水稀釋成不同的濃度。在24孔培養板的每個孔中加入1.0 mL測試液和15 ± 3 個金星幼蟲，每個濃度均設3個復孔。等體積無菌過濾海水做空白對照。將24孔培養板在24℃溫度和15 h亮:9 h暗的光照周期下培養48 h后，在顯微鏡下統計附著幼蟲的數目。用SPSS VIersion 11數據統計軟件進行統計分析。
結果表明上述濃度下，心葉青藤提取物有顯著抑制紋藤壺幼蟲附著的能力。結果見表1。
表1 心葉青藤根提取物對紋藤壺幼蟲附著的抑制作用
實施例2 用心葉青藤進一步試驗
用心葉青藤植物根進一步試驗。這并非暗示青藤屬其它植物沒有活性。
分別用體積百分比為70%的丙酮/水、80%的乙醇/水及90%的甲醇/水作提取溶劑，重復實施例1。結果見表2。實驗結果表明用70%的丙酮/水、80%的乙醇/水及90%的甲醇/水作提取溶劑分別所獲得的心葉青藤根70%丙酮提取物、心葉青藤根80%乙醇提取物和心葉青藤根90%甲醇提取物同樣具有顯著的抗生物污損活性，因此用不同濃度的丙酮/水或乙醇/水或甲醇/水作提取溶劑同樣可以獲得心葉青藤中的抗生物污損活性成分。
表2 心葉青藤根不同溶劑提取物對紋藤壺幼蟲附著的抑制作用。
實施例3 從心葉青藤根中分離鑒定抗生物污損活性化合物
將干燥的心葉青藤的根粉碎成粒徑0.1~0.5 cm大小的顆粒，然后用90%乙醇回流3次，每次2小時；提取液過濾并用旋轉蒸發儀減壓濃縮去溶劑制成浸膏；然后將浸膏混懸于水中（每100 g浸膏300 mL水），依次用石油醚（與水體積比1:1）、乙酸乙酯（與水體積比1:1）以及正丁醇（與水體積比1:1）進行萃取，再用旋轉蒸發儀蒸去溶劑，分別得萃取物56 g，97 g，92 g。
取乙酸乙酯萃取部分浸膏(90 g)經硅膠柱色譜（100-200 目），用氯仿-甲醇(體積比1:0～2:1)梯度洗脫得到13個組分(Fr.1～Fr.13)。Fr.7 (8.1 g)經硅膠柱層析，用二氯甲烷：甲醇 (體積比30:1~0:1)梯度洗脫得到組分Fr.7a~7d。Fr.7c經硅膠柱層析，用二氯甲烷：甲醇 (體積比15:1)洗脫得到Fr.7c-1~6。Fr.7c-2 (1.1 g)以甲醇：水(體積比30:70)為流動相，經HPLC制備得到化合物1；Fr.7c-4 (0.9 g)以甲醇：水(體積比25: 75)為流動相，經HPLC制備得到化合物2；Fr.8 (12 g)經硅膠柱層析，用二氯甲烷：甲醇(體積比30:1~0:1)梯度洗脫得到組分Fr.8a~8h。Fr.8b (2.1 g)經硅膠柱層析，用二氯甲烷：甲醇(體積比20:1)洗脫得到組分Fr.8b-1~5。Fr.8b-2 (0.7 g)以甲醇：水(體積比61：39)為流動相，經HPLC制備得到化合物3；心葉青藤根中抗生物污損活性成分的分離鑒定流程見圖1。
本發明的化合物的化學結構用核磁共振譜（1H NMR, 13C NMR, DEPT）、ESI-MS（陽離子模式）等波譜圖鑒定。根據分析化合物1~3的波譜數據，并參考相關文獻分別鑒定為左旋黃肉楠堿，蓮葉桐堿及右旋黃肉楠堿。
化合物1的理化數據：無色針狀晶體(甲醇)，碘化鉍鉀顯陽性，mp: 205-206℃。ESI-MS m/z：312 [M + H]+，分子式:C18H17O4N。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.67 (1H, s, H-11), 6.70 (1H, s, H-8), 6.52 (1H, s, H-3), 6.06 (1H, s, OCH2O), 5.92 (1H, s, OCH2O), 3.86(3H, s, 10-OCH3), 3.76 (1H, dd, J = 14.0, 4.8 Hz, H-6a), 3.28 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz, H-5a), 2.92 (1H, m, H-4a), 2.88 (1H, m, H-5b), 2.73 (1H, dd, J= 14.0, 4.8 Hz, H-7b), 2.58 (1H, m, H-4b), 2.56 (1H, t, J = 14.0 Hz, H-7a); 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ:148.4 (C-2), 147.9 (C-10), 147.5 (C-9), 143.0 (C-1), 130.0 (C-7a), 128.2 (C-3a), 128.1 (C-3b), 124.0 (C-11a), 118.0 (C-11b), 116.1 (C-8), 112.3 (C-11), 108.0 (C-3), 102.0 (OCH2O), 56.7 (10-OCH3), 55.0 (C-6a), 44.2 (C-5), 37.0 (C-7), 29.9 (C-4)。
化合物2的理化數據：黃色粉末(甲醇)，碘化鉍鉀顯陽性，mp: 208-209 ℃; ESI-MS m/z: 312 [M+H]+，分子式: C18H17O4N。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 6.85 (1H, d, J = 8.0 Hz H-8), 6.69 (1H, d, J = 8.0 Hz H-9), 6.63 (1H,s, H-3), 6.00 (1H, d, J = 1.2 Hz, OCH2O), 5.86 (1H, d, J = 1.2 Hz, OCH2O), 3.78 (3H, s, 11-OCH3), 3.46 (1H, dd, J = 13.2, 3.6 Hz, H-6a), 3.12 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz, H-5a), 2.77 (1H, m, H-4a), 2.71(1H, m, H-5b), 2.67 (1H, dd, J = 13.2, 3.6 Hz, H-7b), 2.55 (1H, m, H-4b), 2.29 (1H, t, J = 13.2 Hz, H-7a); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 147.2 (C-11), 146.1 (C-2), 143.7 (C-10), 141.9 (C-1), 130.2 (C-3a), 129.8 (C-7a), 126.5 (C-1b), 118.0 (C-8), 117.5 (C-11a), 113.8 (C-9), 110.9 (C-1a), 107.1 (C-3), 99.9 (OCH2O), 56.1 (11- OCH3), 54.1 (C-6a), 42.6 (C-5), 37.5 (C-7), 29.0 (C-4)。
化合物3的理化數據：白色針狀晶體(甲醇)，碘化鉍鉀顯陽性，mp: 207-208 ℃; [α] = + 61o (c = 0.97, MeOH); ESI-MS m/z: 312 [M+H]+，分子式：C18H17O4N。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.41 (1H, s, H-11), 6.64 (1H, s, H-8), 6.52 (1H, s, H-3), 6.06 (1H, d, J = 1.2 Hz, OCH2O), 5.89 (1H, d, J =1.2 Hz, OCH2O), 3.98 (1H, dd, J = 13.8, 4.8 Hz, H-6a), 3.74 (3H, s, 10-OCH3), 3.63 (1H, m, H-5b), 3.15 (2H, m, H-4b and 5a), 2.91 (1H, m, H-7b), 2.83 (1H, m, H-4a), 2.77 (1H, m, H-7a); 13C NMR (100 MHz , CD3OD) δ: 149.7 (C-10), 148.1 (C-2), 147.6 (C-1), 143.7 (C-9), 126.3(C-7a), 125.3 (C-3a), 123.0 (C-3b), 121.0 (C-11a), 117.6 (C-1a), 116.0 (C-11), 111.9 (C-8), 107.7 (C-3), 102.6 (OCH2O), 56.4 (10- OCH3), 54.2 (C-6a), 42.6 (C-5), 33.6 (C-7), 26.3 (C-4)。
實施例4 測定所述阿樸啡類生物堿的抗藤壺幼蟲附著活性
采用抑制紋藤壺金星幼蟲附著的實驗模型（可參見科技文獻：Xu Y., He H. P., Qian P. Y., et al. Potent antifouling compounds produced by marine streptomyces. Bioresource Technology. 2010,101(4):1331-1336），測試化合物的抗藤壺幼蟲附著活性。紋藤壺成蟲（Darwin）采自香港(22°19'N，114°16'E)潮間帶。在12 L的聚苯乙烯塑料培養容器中放入8 L過濾的海水，然后將紋藤壺成蟲放入容器中，放置讓其釋放幼蟲，2.5 h后收集幼蟲，該階段的幼蟲稱為無節幼蟲(nauplius)，沒有附著能力。將無節幼蟲放入裝有8 L過濾海水(濾膜孔徑為0.22 μm)的容器中，在24℃溫度和15 h亮:9 h暗的光照周期下通氣培養，并喂食角毛硅藻(Chaetoceros gracilis Schutt)，培養3天以后收集幼蟲備用，該階段的幼蟲稱為金星幼蟲(cypris)，有附著能力。將3種阿樸啡類生物堿分別溶于二甲亞砜(DMSO)中，然后用無菌過濾海水稀釋成不同的濃度。在24孔培養板的每個孔中加入1.0 mL測試液和15 ± 3 個金星幼蟲，每個濃度均設3個復孔。等體積無菌過濾海水做空白對照。將24孔培養板在24℃溫度和15 h亮:9 h暗的光照周期下培養48 h后，在顯微鏡下統計附著幼蟲的數目。用SPSS VIersion 11數據統計軟件進行統計分析。3種阿樸啡類生物堿在不同濃度下抗藤壺幼蟲附著的實驗結果如圖2-4所示。
實驗結果按照Rittschof等研究人員的方法（參見科技文獻：Richard B. F., DaVIid A. Z. F., Dan R. Molting of megalopae from the blue crab Callinectes sapidus: effects of offshore and estuarine cues. Marine ecology progress series.1994,113:55-59）進行分析。根據實驗結果可得到48 h的EC50（半抑制附著濃度，即抑制幼蟲附著率為最大抑制幼蟲附著率的50%時所對應的濃度），由EC50可知檢測物質抗生物污損活性的高低。而在24 h后，計算幼蟲的死亡數目，根據實驗結果可得到24 h的LC50(半致死濃度)，由LC50/EC50（毒效比）可知檢測物質對藤壺幼蟲的毒性大小。實驗分析結果表明左旋黃肉楠堿，蓮葉桐堿及右旋黃肉楠堿都有顯著抑制紋藤壺幼蟲附著的活性，并且3種化合物活性比較接近。AVIelin等研究人員（參見科技文獻：Mary A., Mary VI., Rittschof D., Nagabhushanam R. Bacterial-barnacle interaction: potential of using juncellins and antibiotics to alter structure of bacterial communities. J Chem. Ecol. 1993,19(10):2155-2167.）指出，毒效比大于10以上的抗生物污損化合物為無毒抗生物污損化合物。所測試的3種化合物的毒效比都大于10，表明這3種化合物抑制紋藤壺幼蟲附著，但對紋藤壺幼蟲沒有毒性。結果見表3。
表3 3種阿樸啡類生物堿對紋藤壺幼蟲附著的抑制作用
實施例5 防污涂料的制備
取本發明涉及的抗生物污損活性成分，采用現有技術制備防污涂料，例如，將活性成分摻入或擴散于成膜天然樹脂、氯乙烯醋酸乙烯共聚物以及其它可水解、可溶或不溶性樹脂等聚合物中。防污涂料應釋放出足量有效的活性成分至表面防止生物污損。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
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