菁類化合物在制備生物染色劑中的應用的制作方法

文檔序號：11897458閱讀：299來源：國知局

本發明涉及一類菁類化合物在生物染色方面的新的應用。

背景技術：

熒光染料作為功能性色素在科學技術的各個領域得到廣泛應用，尤其在生命科學、臨床醫療診斷、免疫分析檢測等方面的研究在全世界備受矚目。目前，菲啶類(EB、PI)、吖啶類(AO)、咪唑類(Hoechst、DAPI)和花菁家族類(Cy、TOTO、SYTO)等商品化熒光染料在基因組學技術、核酸定量檢測、細胞分析等領域中都起到了重要的作用。然而，這些染料都各自存在著應用的局限性。例如，有相當一部分熒光染料的激發光處在紫外光區，由于紫外光對細胞內的核酸、蛋白等組分會造成嚴重的損傷，因此這類熒光在熒光顯微技術中的使用受到光激發時間的限制(Davis SK,Bardeen CJ.Photochem Photobiol 2003；77:675–679)。此外，在紫外區進行熒光檢測時，生物樣品在這個區間的吸收使光進入生物組織內部變得困難，同時生物樣品中某些成分的自發熒光形成很強的背景干擾，使檢測效率大大降低。因此，研究開發出具有良好熒光光譜性能、對特殊細胞具有選擇性、毒性小的新型熒光染料仍然是推動熒光分析技術和生命科學等領域發展的關鍵和核心。

在眾多種類的熒光染料化合物中，菁類熒光染料以其波長范圍寬，摩爾消光系數大，熒光量子產率適中等優點。其中喹啉類不對稱菁類熒光染料，通過改變多亞甲基鏈的長度和兩端的芳香母核(噻唑、惡唑、喹啉、吡啶和吲哚啉)的結構可以得到不同的異二聚體類似物和衍生物。這類染料在溶液中幾乎無熒光，降低了檢測過程中的熒光背景干擾，與核酸結合后熒光增強。專利ZL201010022414.6,US8298766及JP5671525等描述了一類激發和發射波長大于630納米的近紅外染料，這類染料可用于核酸熒光識別及在活細胞中對核酸熒光成像。但細胞由許多組分組成，如蛋白質、核酸、小分子物質等。另外，細胞在不同成長階段、不同環境下、不同病變條件下，都會有不同的狀態。但具有這類復雜條件下，對活細胞、死細胞染色、非正常細胞染色的菁類近紅外染料(激發和發射波長大于630納米)的很少。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一類菁類化合物在制備生物染色劑中的應用，所述的菁類化合物具有通式I的結構：

通式I中，

X為C(CH₃)₂、O、S或Se；

Y^-選自鹵素離子、ClO₄^-、PF₆^-、BF₄^-、CH₃COO^-或OTs^-。

上述本發明所述的通式I的化合物的結構及其合成方法在現有技術中已有報導，本領域技術人員可以根據現有技術信息獲得所述結構的化合物。本發明提供合成路線之一作為具體的實施方式：

關于上述通式I的化合物，現有技術的認知限于其結構、合成及有限的功能。可以確認，本領域的技術人員并未意識到此類化合物具有特異的RNA定位的功能。相反，具有類似結構的化合物，如結構中包含乙基的化合物E-TO3，所針對性的識別對象是DNA而非RNA。化合物E-TO3的結構如下所示：

鑒于此，本發明尤其提供如通式I的化合物在制備生物染色劑，尤其是細胞染色劑，更為具體的是RNA特異性染色試劑中的應用。

上述本發明中所涉及的通式I的化合物，中，所述的X為C(CH3)₂、O或S；優選C(CH3)₂或S；更優選X為S。

另一方面，通式I中，所述的Y^-為鹵素離子；優選Y^-為I^-。

更進一步，我們的發明中，通過實驗證明，本發明所述的通式I的化合物作為RNA特異性識別的熒光染料，還具有以下諸多方面的特點：

(1)與核酸的結合后熒光量子產率增大，提高了檢測靈敏度。

(2)具有良好的細胞膜通透性，應用范圍增大。

(3)化合物發射波長范圍寬，可達630nm～900nm的近紅外區，可避免生物自身的熒光背景干擾。

本發明的這些特征和優點以及其他特征和優點在參考以下附圖和本發明的具體實施方式之后將變得顯而易見。

附圖說明

本發明附圖7幅:

圖1是化合物TO-3與商業化RNA染料SYTO RNA Select^TM的活細胞定位，染料TO-3使用Cy5(633nm)通道激發，發射收集645-695nm波段，SYTO RNA Select^TM使用FITC(488nm)通道激發，發射收集495-545nm波段，結果顯示化合物TO-3與商業化RNA染料呈現相同染色效果。

圖2是化合物TO-3與化合物E-TO3的活細胞定位，使用Cy5(633nm)通道激發，發射收集645-695nm波段。結果顯示，化合物TO-3與化合物E-TO3活細胞定位有明顯區別，化合物TO-3主要定位細胞核仁內的RNA，而化合物E-TO3無法定位細胞核仁RNA。

圖3是化合物E-TO3與商業化RNA染料SYTO RNA Select^TM的活細胞定位，染料E-TO3使用Cy5(633nm)通道激發，發射收集645-695nm波段，SYTO RNA Select^TM使用FITC(488nm)通道激發，發射收集495-545nm波段，結果顯示化合物E-TO3與商業化RNA染料SYTO RNA Select^TM在細胞質和細胞核內染色效果都不相同，化合物E-TO3無法選擇性定位細胞內的RNA。

圖4是化合物OO-3，TO-3，IO-3與商業化RNA染料SYTO RNA Select^TM的活細胞定位，染料TO-3使用Cy5(633nm)通道激發，發射收集645-695nm波段，化合物OO-3，IO-3使用559nm通道激發，發射收集為600-650nm波段，SYTO RNA Select^TM使用FITC(488nm)通道激發，發射收集495-545nm波段，結果顯示化合物OO-3，TO-3，IO-3與商業化RNA染料呈現相同定位效果。

圖5是化合物TO-3的細胞消化酶實驗，使用Cy5(633nm)通道激發，發射收集645-695nm波段，結果顯示，左圖對照組(control)中化合物EO-3可以定位于死細胞核內，且主要集中在核仁區域，DNase圖中，由DNA消化酶處理過的細胞，其細胞核尤其是核仁區域的熒光強度與對照組相比無明顯變化；而RNase圖中，經RNA消化酶處理過的細胞，其核仁區域的熒光強度明顯降低。

圖6是化合物OO-3的細胞消化酶實驗，使用559nm通道激發，發射收集為600-650nm波段。結果顯示，左圖對照組(control)中化合物OO-3可以定位于死細胞核內，且主要集中在核仁區域，DNase圖中，由DNA消化酶處理過的細胞，其細胞核尤其是核仁區域的熒光強度與對照組相比無明顯變化；而RNase圖中，經RNA消化酶處理過的細胞，其核仁區域的熒光強度明顯降低。

圖7是化合物IO-3的細胞消化酶實驗，使用559nm通道激發，發射收集為600-650nm波段。結果顯示，左圖對照組(control)中化合物IO-3可以定位于死細胞核內，且主要集中在核仁區域，DNase圖中，由DNA消化酶處理過的細胞，其細胞核尤其是核仁區域的熒光強度與對照組相比無明顯變化；而RNase圖中，經RNA消化酶處理過的細胞，其核仁區域的熒光強度明顯降低。

具體實施方式

除另有說明外，本文中使用的術語具有以下含義。

本文中使用的術語“鹵素”包括氟、氯、溴和碘。

本文中使用Y^-表示負離子，其可為任何合適的負離子，包括無機負離子和有機負離子，可舉例但不限于鹵素離子、ClO₄^-、PF₆^-、BF₄^-、CH₃COO^-或OTs^-。

本發明旨在提供如通式I的菁類化合物在制備生物染色劑中的應用。其中所述的生物染色劑可以是通式I的菁類化合物的鹽、或者是式Ⅰ化合物的衍生物，也可以是包括這些化合物的組合物。

本發明中所涉及的生物染色劑典型地用于熒光激活細胞分選儀(FACS)中。可與本發明所涉及的生物染色劑綴合的分子可為與細胞或細胞成分特異性結合的分子，包括但不限于抗體、抗原、受體、配體、酶、底物、輔酶等。通常，測試樣品與生物染色劑溫育一段時間，使得熒光染料與測試樣品中的某些細胞或細胞成分特異性結合，熒光染料與細胞或細胞成分的結合也可被稱為染色。該染色步驟可依次進行多次，或用多種染料同時進行多種染色。染色完成后，樣品在熒光激活細胞分選儀或熒光測定裝置中進行分析，其中激發光源激發本發明熒光染料，而測定裝置測定由激發的熒光染料產生的發射光。本發明通常使用半導體激光器。

所述生物染色劑可以是包含式Ⅰ化合物的組合物，該組合物中還可包含生物樣品染色所需要的其它組分，例如溶劑、滲透壓調節劑、pH調節劑、表面活性劑等。生物染色劑染色劑可作為水溶液形式存在，或者可作為臨用前用水配制為溶液的其它合適形式存在。

為了說明本發明的化合物在結構中引入甲基團后對染料性能的優化改進，實施已知化合物E-TO3為參照。

實施例1

化合物1-乙基-4-[3-(3-乙基苯并噻唑-2-亞基)丙烯基]喹啉碘(E-TO3)結構式為：

化合物E-TO3按照下述路線合成：

在50mL的圓底燒瓶中，將半菁染料中間體1-乙基-2-[(2-苯胺基)乙烯基]苯并噻唑碘鹽(2.0mmol)和1-乙基-4-甲基喹啉季銨鹽(2mmol)溶于20mL的1:1(v/v)CH₂Cl₂/CH₃OH中，分別滴加2mL的三乙胺及醋酐作催化劑。燒瓶用鋁箔紙包裹避光，置于油浴中緩緩加熱，持續攪拌室溫反應1.5h。將反應液倒入乙醚中，析出粗產品，用乙醚充分洗滌，然后硅膠柱層析進一步純化，得深藍色固體。HR-TOF-MS m/z Found:359.1595C₂₃H₂₃N₂S(M+):requires M,359.1576.¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝1.33(t,3H,CH₃,J＝6.8Hz)；1.45(t,3H,CH3,J＝8.0Hz)；4.30(q,2H,CH₂,J＝8.0Hz)；4.61(q,2H,CH₂,J＝7.2Hz)；6.53(d,1H,CH,J＝12Hz)；7.14(d,1H,CH,J＝11.2Hz)；7.32(t,1H,ArH,J＝7.8Hz)；7.50(t,1H,ArH,J＝7.8Hz)；7.61(d,1H,ArH,J＝7.8Hz)；7.71(t,1H,ArH,J＝7.8Hz)；7.88-7.90(m,2H,ArH)；7.97(t,1H,ArH,J＝7.8Hz)；8.10(d,1H,ArH,J＝7.8Hz),8.17(t,1H,CH,J＝11.2Hz),8.44-8.49(m,2H,ArH).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ＝12.8,15.2,41.2,49.8,98.8,109.9,110.4,112.7,118.3,123.2,124.6,124.8,125.3,125.7,127.2,128.2,133.9,138.2,141.5,142.7,144.5,150.9,161.1.

實施例2

化合物1-甲基-4-[3-(3-甲基苯并噻唑-2-亞基)丙烯基]喹啉碘(TO-3)結構式為：

化合物TO-3按照下述路線合成：

在50mL的圓底燒瓶中，將半菁染料中間體1-甲基-2-[(2-苯胺基)乙烯基]苯并噻唑碘鹽(2.0mmol)和1-甲基-4-甲基喹啉季銨鹽(2mmol)溶于20mL的1:1(v/v)CH₂Cl₂/CH₃OH中，分別滴加2mL的三乙胺及醋酐作催化劑。燒瓶用鋁箔紙包裹避光，置于油浴中緩緩加熱，待反應液顏色變為綠色后加熱停止，持續攪拌室溫反應1.5h。將反應液倒入乙醚中，析出暗紫色小顆粒，并用乙醚充分洗滌。粗產品用硅膠柱層析，CH₂Cl₂/CH₃OH混合溶劑梯度洗脫。收集藍色部分，得到深藍色固體,HR-TOF-MS m/z Found:331.1273C₂₁H₁₉N₂S⁺(M⁺):requires M,331.1269.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝3.72(s,3H,CH₃)；4.13(s,3H,CH₃)；6.47(d,1H,CH,J＝12.4Hz)；7.12(d,1H,CH,J＝13.2Hz)；7.31(t,1H,ArH,J＝7.6Hz)；7.49(t,1H,ArH,J＝7.6Hz)；7.58(d,1H,ArH,J＝8.8Hz)；7.74(t,1H,ArH,J＝6Hz)；7.87(d,2H,ArH,J＝7.6Hz)；7.99(m,2H,ArH)；8.15(t,1H,CH,J＝13.2Hz)；8.41(d,1H,ArH,J＝7.6Hz)；8.48(d,1H,ArH,J＝8.8Hz).13C NMR(100MHz,MeOD-d₄):δ＝32.8,42.2,98.5,109.2,109.5,112.4,118.0,122.4,124.0,124.5,124.9,126.8,127.6,133.3,138.8,142.0,143.2,143.5,150.4.

實施例3

化合物1-甲基-4-[3-(3-甲基苯并惡唑-2-亞基)丙烯基]喹啉碘(OO-3)結構式為：

化合物OO-3按照下述路線合成：

在50mL的圓底燒瓶中，將半菁染料中間體1-甲基-2-[(2-苯胺基)乙烯基]苯并惡唑碘鹽(2.0mmol)和1-甲基-4-甲基喹啉季銨鹽(2mmol)溶于20mL的1:1(v/v)CH₂Cl₂/CH₃OH中，分別滴加2mL的三乙胺及醋酐作催化劑。燒瓶用鋁箔紙包裹避光，置于油浴中緩緩加熱，持續攪拌室溫反應1.5h。將反應液倒入乙醚中，析出粗產品，用乙醚充分洗滌，然后硅膠柱層析進一步純化，得藍色固體。HR-TOF-MS m/z Found:315.1506C₂₁H₁₉N₂O⁺(M⁺):requires M,315.1492.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ＝8.46(d,J＝8.5Hz,1H),8.37(d,1H),7.95(t,J＝6.7Hz,2H),7.80(d,1H),7.74(t,J＝5.5Hz,1H),7.59(d,J＝8.2Hz,1H),7.53(t,2H),7.48(d,2H),7.39(t,J＝14.5,6.7Hz,1H),7.30(t,1H),7.06(d,J＝13.7Hz,1H),5.88(d,1H),4.11(s,3H),3.66(s,3H)..13C NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝30.0,42.0,107.2，108.8，110.3,112.1,117.2,118.0,123.8,124.0,124.8,125.4,126.6,129.8,132.3,133.2,138.8,143.0,146.3,150.9,160.9.

實施例4

化合物1,3,3-三甲基-2-[3-(1-甲基-1H-喹啉-4-亞基)-丙烯基]-3H-吲哚碘(IO-3)結構式為：

化合物IO-3按照下述路線合成：

在50mL的圓底燒瓶中，將半菁染料中間體1,3,3-三甲基-2-(2-苯基氨基-乙烯基)-3H-吲哚碘鹽(2.0mmol)和1-甲基-4-甲基喹啉季銨鹽(2mmol)溶于20mL的1:1(v/v)CH₂Cl₂/CH₃OH中，分別滴加2mL的三乙胺及醋酐作催化劑。燒瓶用鋁箔紙包裹避光，置于油浴中緩緩加熱，持續攪拌室溫反應1.5h。將反應液倒入乙醚中，析出粗產品，用乙醚充分洗滌，然后硅膠柱層析進一步純化，得藍色固體。HR-TOF-MS m/z Found:341.2010,C₂₄H₂₅N₂⁺(M⁺):requires M,341.2021.¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ＝8.64(2H,m),8.33(1H,d,J＝12.0Hz),8.13(3H,m),7.81(1H,m),7.51(1H,d,J＝6.0Hz),7.33(2H,m),7.18(1H,d,J＝6.0Hz),7.08(1H,t),6.21(1H,d,J＝12.0Hz),4.28(3H,s),3.46(3H,s),1.69(6H,s)；¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)δ＝168.1,151.8,144.4,143.5,142.8,140.0,138.9,133.7,128.2,127.4,125.3,124.5,122.5,122.1,118.6,112.5,111.4,109.2,100.1,62.1,47.5,43.0,30.1,28.2,25.5.

實施例5

化合物TO-3和商業化RNA染料SYTO RNA Select^TM的對比測試

(1)化合物1-乙基-4-[3-(3-乙基苯并噻唑-2-亞基)丙烯基]喹啉碘(TO-3)和商業化RNA染料SYTO RNA Select^TM(熒光數據已知)在PH7.4，濃度10mM Tris-HCl緩沖液中光譜和活細胞定位數據。紫外吸收和熒光發射光譜分別在HP-8453紫外分光光度計和FP-6500熒光分光光度計上測得，樣品質量采用BS-210S萬分之一電子天平稱量。檢測結果如表1.

表1

(2)化合物TO-3和SYTO RNA Select^TM的活細胞熒光成像結果如附圖1所示：右圖為SYTO RNA Select^TM和TO-3的活細胞熒光成像圖的疊加，染料TO-3使用Cy5(633nm)通道激發，發射收集645-695nm波段，SYTO RNA Select^TM使用FITC(488nm)通道激發，發射收集495-545nm波段，共聚焦激光掃描顯微鏡型號：TCS-SP2，物鏡放大倍數為60倍，結果顯示，染料TO-3與商業化RNA染料SYTO RNA Select^TM的活細胞定位效果相同。

實施例5

化合物TO-3、E-TO3的活細胞共定位

活的HeLa細胞首先分別與4μM的TO-3、E-TO3依照之前的染色操作孵育30min。用PBS磷酸緩沖液(0.2M的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，pH＝7.0)將細胞洗滌兩次后，加入新鮮的培養基于共聚焦專用皿中。活細胞熒光成像使用TCS-SP2共聚焦激光掃描顯微鏡，物鏡放大倍數為100倍。使用Cy5(633nm)通道激發，發射收集645-695nm波段。

兩個化合物能夠特異清晰的描述出染色質DNA(富集于細胞核)及RNA(富集于核仁)在活細胞內的分布。從圖2中可以看出，TO-3對核仁RNA呈強烈清晰染色。值得注意的是，N-乙基取代苯并噻唑雜環與N-甲基取代苯并噻唑雜環的差別，導致E-TO3呈現較強的細胞核DNA染色，核仁RNA較少，說明在活細胞內，E-TO3對DNA響應要強于對RNA響應，而TO-3則在活細胞對RNA有更好的選擇性。

實施例5

化合物E-TO3與商業化RNA染料SYTO RNA Select^TM的活細胞共定位

活的MCF-7細胞首先分別與4μM的OO-3、TO-3、IO-3的染色操作孵育30min。用PBS磷酸緩沖液(0.2M的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，pH＝7.0)將細胞洗滌兩次后，加入新鮮的培養基于共聚焦專用皿中。為了考察化合物與RNA的共定位，向培養皿中加入RNA選擇性染料SYTO RNA Select^TM，染色終濃度為4μM，于37℃，5％CO₂條件下再孵育30min。隨后，吸掉培養基，用PBS磷酸緩沖液將細胞洗滌三次，以備在激光共聚焦掃描顯微鏡下進行熒光觀察。活細胞熒光成像使用TCS-SP2共聚焦激光掃描顯微鏡，物鏡放大倍數為60倍。化合物E-TO3使用Cy5(633nm)通道激發，發射收集645-695nm波段，SYTO RNA Select^TM使用FITC(488nm)通道激發，發射收集495-545nm波段。結果如圖3所示，N-乙基取代苯并噻唑雜環化合物E-TO3在細胞核和細胞質中與商業化RNA染料SYTO RNA Select^TM呈現不同的定位結果。

實施例6

化合物OO-3、TO-3、IO-3與商業RNA染料的活細胞共定位

活的MCF-7細胞首先分別與4μM的OO-3、TO-3、IO-3的染色操作孵育30min。用PBS磷酸緩沖液(0.2M的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，pH＝7.0)將細胞洗滌兩次后，加入新鮮的培養基于共聚焦專用皿中。為了考察化合物與RNA的共定位，向培養皿中加入RNA選擇性染料SYTO RNA Select^TM，染色終濃度為4μM，于37℃，5％CO₂條件下再孵育30min。隨后，吸掉培養基，用PBS磷酸緩沖液將細胞洗滌三次，以備在激光共聚焦掃描顯微鏡下進行熒光觀察。活細胞熒光成像使用TCS-SP2共聚焦激光掃描顯微鏡，物鏡放大倍數為60倍。化合物TO-3使用Cy5(633nm)通道激發，發射收集645-695nm波段，化合物OO-3、IO-3使用559nm通道激發，發射收集600-650波段。SYTO RNA Select^TM使用FITC(488nm)通道激發，發射收集495-545nm波段。結果如圖4所示。三個化合物和商業化RNA選擇性染料SYTO RNA Select^TM呈現相同的定位效果。

實施例7

化合物TO-3的細胞消化酶實驗

取出于37℃細胞培養箱中孵育的MCF-7細胞，移去舊培養基，PBS緩沖液(0.2M的NaH2PO4-Na2HPO4，pH＝7.0)清洗兩次，用-20℃的冰乙醇清洗后加入2mL冰乙醇，置于-20℃冰箱中5min。取出后用PBS清洗兩次后，加入2mL PBS，將共聚焦皿置于4℃冰箱中保存。向兩組共聚焦皿中分別加入DNA和RNA消化酶，另外一組作為對照試驗。2h后吸去原有PBS，再用PBS洗滌兩次，加入4μM的TO-3共孵育30min，然后移去PBS，再用PBS洗滌三次，以備在激光共聚焦掃描顯微鏡下進行熒光觀察。細胞熒光成像使用TCS-SP2共聚焦激光掃描顯微鏡，物鏡放大倍數為60倍。化合物TO-3使用Cy5(633nm)通道激發，發射收集為645-695nm波段。從圖5可以看出，左圖對照組(control)中化合物TO-3可以定位于死細胞核內，且主要集中在核仁區域，DNase圖中，由DNA消化酶處理過的細胞，其細胞核尤其是核仁區域的熒光強度與對照組相比無明顯變化；而RNase圖中，經RNA消化酶處理過的細胞，其核仁區域的熒光強度明顯降低。

實施例7

化合物OO-3的細胞消化酶實驗

取出于37℃細胞培養箱中孵育的MCF-7細胞，移去舊培養基，PBS緩沖液(0.2M的NaH2PO4-Na2HPO4，pH＝7.0)清洗兩次，用-20℃的冰乙醇清洗后加入2mL冰乙醇，置于-20℃冰箱中5min。取出后用PBS清洗兩次后，加入2mL PBS，將共聚焦皿置于4℃冰箱中保存。向兩組共聚焦皿中分別加入DNA和RNA消化酶，另外一組作為對照試驗。2h后吸去原有PBS，再用PBS洗滌兩次，加入4μM的OO-3共孵育30min，然后移去PBS，再用PBS洗滌三次，以備在激光共聚焦掃描顯微鏡下進行熒光觀察。細胞熒光成像使用TCS-SP2共聚焦激光掃描顯微鏡，物鏡放大倍數為60倍。化合物OO-3使用559nm通道激發，發射收集為600-650nm波段。從圖6可以看出，左圖對照組(control)中化合物OO-3可以定位于死細胞核內，且主要集中在核仁區域，DNase圖中，由DNA消化酶處理過的細胞，其細胞核尤其是核仁區域的熒光強度與對照組相比無明顯變化；而RNase圖中，經RNA消化酶處理過的細胞，其核仁區域的熒光強度明顯降低。

實施例7

化合物IO-3的細胞消化酶實驗

取出于37℃細胞培養箱中孵育的MCF-7細胞，移去舊培養基，PBS緩沖液(0.2M的NaH2PO4-Na2HPO4，pH＝7.0)清洗兩次，用-20℃的冰乙醇清洗后加入2mL冰乙醇，置于-20℃冰箱中5min。取出后用PBS清洗兩次后，加入2mL PBS，將共聚焦皿置于4℃冰箱中保存。向兩組共聚焦皿中分別加入DNA和RNA消化酶，另外一組作為對照試驗。2h后吸去原有PBS，再用PBS洗滌兩次，加入4μM的IO-3共孵育30min，然后移去PBS，再用PBS洗滌三次，以備在激光共聚焦掃描顯微鏡下進行熒光觀察。細胞熒光成像使用TCS-SP2共聚焦激光掃描顯微鏡，物鏡放大倍數為60倍。化合物IO-3使用559nm通道激發，發射收集為600-650nm波段。從圖7可以看出，左圖對照組(control)中化合物IO-3可以定位于死細胞核內，且主要集中在核仁區域，DNase圖中，由DNA消化酶處理過的細胞，其細胞核尤其是核仁區域的熒光強度與對照組相比無明顯變化；而RNase圖中，經RNA消化酶處理過的細胞，其核仁區域的熒光強度明顯降低。

以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的保護范圍。作為熒光染料是本發明新化合物的一種用途，不能認定本發明的化合物僅用于熒光染料，對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在基于本發明化合物用作熒光染料的相同作用機理的考慮下，還可以做出若干簡單推理，得出本發明的化合物的其他應用用途，都應當視為屬于本發明的保護范圍。

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