一種碳量子點的制備方法及其應用與流程

本發明屬于納米檢測技術領域，具體涉及一種碳量子點的制備方法及其檢測汞離子和顯現指紋的應用。

背景技術：

碳元素是地球和宇宙中含量較為豐富的元素，重要的是地球上的生命都是以碳元素為基礎的，所以碳的納米材料與其它元素的納米材料相比，對生物體的毒性要低很多，生物安全性也較高，基本不會帶來環境問題。逐漸地，碳量子點（也稱為碳點）成為碳納米家族中一顆耀眼的新星。然而，它之所以越來越受人們的關注，是因為它與傳統的半導體量子點和有機染料相比，熒光碳量子點具有更好的水溶性、耐光漂白性、低毒、生物相容性等等。因此它可以被應用在生物標記、檢測等領域。

日常生活和生產中的重金屬元素未經處理或處理未達到標準就被排放到環境中，它們不僅不能被生物降解，而且會在生物放大作用下，通過大氣、水體、食物鏈等傳播，不斷富集，最后進入人體。重金屬元素在人體內和蛋白質等發生強烈的相互作用，使蛋白質失去活性。同時，重金屬元素也可能在人體的某些器官中累積，造成慢性中毒。目前，在環境監測分析中，重金屬離子的測定方法主要有：絡合滴定法、電化學分析法、高效液相色譜法、離子色譜法、氣相色譜法、熒光分析法、原子吸收光譜法和質譜法等[Evans E.H., Day J.A., Palmer C.D., et al. Journal of analytical atomic spectrometry. 2005, 20(6): 562-590; Evans E.H., Dawson J.B., Fisher A., et al. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 2002, 17(6): 622-651; Butler O.T., Cook J.M., Davidson C.M., et al. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 2009, 24(2): 131-177; Michalski R. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 2009, 39(4): 230-250.]。雖然這些方法靈敏而且可靠，但是存在一些不足之處：1）需要昂貴的大型儀器設備；2）樣品制備和處理過程較為復雜；3）選擇性差；4）無法及時實現現場快速檢測等。近年來，人們致力于檢測重金屬離子的化學傳感器研究，并且發展了一些有關重金屬離子的熒光傳感方法（即熒光探針法）。熒光探針法具有線性動態范圍寬、光譜干擾少、靈敏度高以及多元素檢測功能強等優點，并且用于檢測熒光光譜的熒光分光光度計設備費用較低，可以同時檢測固體或液體樣品，樣品的制備簡單，無需繁瑣處理，成為目前廣泛應用的分析方法。

汞是一種具有劇毒卻又普遍存在于自然界的污染物。汞污染會造成對腦、神經系統、內分泌系統、腎臟嚴重的傷害。水溶性的二價汞離子(Hg²⁺)是汞污染物中最平常和最穩定的形式之一。因此，環境中的水溶性的Hg²⁺的檢測和監測的研究逐漸成為各國環境工作者研究的熱點。熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡便、工作曲線線性范圍寬等優點。因此，研發新型熒光傳感器并應用于環境水樣中Hg²⁺的監測具有十分重要的意義，此外，在活體細胞中檢測重金屬汞離子，能夠準確判斷汞離子的污染程度，從而全面進行生態分析，對環境的保護和治理具有至關重要的作用。

我們所制備的熒光碳量子點不但可以檢測Hg²⁺，同時也可用于指紋的顯現與識別。指紋是重要的個體識別特征，通過提取指紋，在事故的調查和處理中，能提供確切的身份識別；在法庭科學和刑事訴訟過程中，起著重要的證據作用。因此，科學正確地發現、提取、顯現鑒定指紋對于開展偵查工作、懲治犯罪具有重要的實踐作用。

在本發明中，我們研究了一種利用一鍋法合成的熒光碳量子點的方法，并且研究了利用碳量子點作為熒光探針來檢測重金屬汞離子并應用于指紋的顯現與識別，且不需要經過表面修飾或改性可直接用于活體細胞熒光成像，可通過熒光成像實現對活體細胞中汞離子的檢測。我們提供的熒光碳量子點的合成方法是簡單的一次性綠色合成路線，因此，本發明提供的方法具備成本低、合成方法簡單、易操作的特點。利用熒光碳量子點溶液作為檢測探針檢測汞離子，是一種操作簡單、快速定量檢測重金屬離子汞的方法。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種碳量子點的制備方法及其檢測汞離子和顯現指紋的應用。

本發明的技術方案如下：

一種碳量子點的制備方法：

首先將1-3 g的檸檬酸三鈉與2-4 g的尿素放入到不銹鋼反應釜中，再向其中加入10-15 mL的二甲基甲酰胺，反應釜封閉后，將混合物加熱至150°C-200°C，反應進行約6-8 h之后，將混合溶液冷卻到室溫，在約6000-8000轉的條件下離心約10 min，去除上清液將固體沉淀烘干得到熒光碳量子點粉末。

所制得的熒光碳量子點粉末在紫外光源下呈現綠色光發射，其熒光光譜在420 nm的波長下激發，碳量子點在530 nm有強的熒光發射峰（附圖1），將碳量子點粉末溶于水得到的熒光碳量子點溶液在370 nm的激發下，發射峰在446 nm處熒光強度最強，通過透射電鏡觀察，碳量子點的粒徑大小約為3-5 nm左右（附圖3）；

2. 如權利要求1所述熒光碳量子點溶液通過熒光檢測的方法，可檢測出水溶液樣品中含有的微量的重金屬離子Hg²⁺，通過熒光成像法還可以實現在活體細胞中檢測汞離子的效果。

熒光碳量子點作為熒光探針檢測Hg²⁺的過程中，過程如下：

（1）檢測靈敏度

為檢驗使用熒光碳量子點（C-dots）作為熒光探針檢測Hg²⁺的靈敏度，需要先配制0.001-100 μM的Hg²⁺溶液，將不同濃度的Hg²⁺溶液分別與C-dots熒光探針反應，然后分別測試樣品的熒光光譜來驗證探針的靈敏度。從熒光光譜（附圖4a）中可以看出，所有混合溶液的熒光發射峰都在446 nm處，與熒光探針C-dots的特征發射一致，并且隨著Hg²⁺濃度的升高，混合溶液中碳量子點溶液的熒光強度是逐漸降低的。混合溶液在紫外燈下熒光發射隨Hg²⁺濃度的增大而降低逐漸被淬滅（附圖4c）。進行檢測靈敏度的反應，熒光碳量子點作為檢測探針的熒光強度與Hg²⁺的濃度在1 nM-5 μM范圍內有良好的線性關系（附圖4b）。因此，熒光碳量子點可以作為檢測汞離子的熒光探針快速并定量地檢測水溶液中汞離子的存在，對汞離子的檢測限可達到1 nM。

（2）檢測選擇性

使用熒光碳量子點溶液作為熒光探針檢測Hg²⁺，需要考察其對Hg²⁺檢測的選擇性。相同條件下，濃度為100 μM的其它金屬溶液離子包括Cd²⁺，Cr³⁺，Cr⁶⁺，Ba²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，Fe³⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Pb²⁺，Ag⁺的溶液，分別與C-dots熒光檢測探針混合反應后測試樣品的熒光光譜，并在紫外燈下觀測其熒光強度。從熒光光譜圖中可以看出，加入其它離子后，C-dots的熒光發射峰都在446 nm處，沒有發生位移。其中Cd²⁺，Cr³⁺，Cr⁶⁺，Ba²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，Fe³⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Pb²⁺的熒光光譜強度較高（附圖5a），在紫外燈照射下，可觀察到C-dots熒光檢測探針呈現綠光發射，沒有出現淬滅現象。而與Hg²⁺混合的C-dots溶液的熒光光譜強度降低，同樣在紫外燈下，與Hg²⁺混合的C-dots熒光檢測探針會出現淬滅現象（附圖5b）。通過比較熒光光譜和其在紫外燈下的熒光發射可說明C-dots熒光檢測探針對Hg²⁺具有很高的選擇性。

利用熒光成法檢測活體細胞中汞離子的存在對判斷環境污染的程度具有重要作用。在本實驗中，我們對Hela細胞進行培養，實驗過程中利用測試活體細胞存活率常用的方法噻唑藍比色法（MTT法）測試碳量子點的毒性，其細胞的生存能力均能達到86%以上，說明碳量子點對生物細胞的毒性可忽略不計。將合成的熒光碳量子點直接用于細胞成像，不需要事先表面修飾，碳量子點即可通過細胞的吞噬作用進入細胞體內，在熒光顯微鏡下可呈現清晰的熒光圖像，實現對活體細胞中汞離子的檢測。

所述碳量子點作為熒光探針可以檢測重金屬汞離子并應用于指紋的顯現與識別，且不需要經過表面修飾或改性可直接用于活體細胞熒光成像，并通過熒光成像法實現對活體細胞中汞離子的檢測。下面結合附圖及實施方式對本發明作進一步詳細的說明：

有益效果：

1、本發明提供了熒光碳量子點熒光檢測探針的制備方法，制得的熒光碳量子點具有強的綠光發射，碳量子點粉末可用于指紋的識別，碳量子點溶液提供的熒光檢測探針靈敏度高、選擇性好，檢測限低，還可實現活體細胞中汞離子的檢測。

2、不需要大型儀器，通過熒光光譜，即可識別檢測結果。

3、本發明易制備和保存；在4°C條件下可保存8～15個月不發生變化。

4、本發明所用試劑和操作過程均無毒副作用。

5、本發明方法簡單、快速、易操作，可進行現場原位快速檢測。

附圖說明

附圖1是熒光碳量子點粉末（C-dots）的熒光光譜圖；

附圖2是熒光碳量子點溶液（C-dots）的紫外光譜圖(左)與熒光光譜圖（右）；

附圖3(a) 碳量子點的透射電鏡照片，插圖為高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）圖；(b) 粒徑分布圖；

附圖4 (a) 碳量子點溶液中加入不同濃度的Hg²⁺溶液(箭頭方向順序0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、40、60、80、100 μM)；(b) 熒光強度與Hg²⁺濃度的線性關系; (c) 相應的熒光照片；

附圖5 (a) 碳量子點中分別加入100 μM Hg²⁺和100 μM 其它離子溶液的熒光光譜圖；(b) 相應的熒光照片；

附圖6湖水樣品的靈敏度檢測熒光光譜圖(a) 碳量子點溶液中加入不同濃度的Hg²⁺溶液(箭頭方向順序0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、40、60、80、100 μM)；(b) 相應的熒光照片；

附圖7湖水樣品的選擇性檢測熒光光譜圖 (a) 碳量子點中分別加入100 μM Hg²⁺和100 μM 其它離子溶液的熒光光譜圖；(b) 相對熒光強度譜圖；(c) 相應的熒光照片；

附圖8是熒光碳量子點粉末用于指紋的識別照片。

附圖9碳量子點與Hela細胞共培養3 h后的熒光顯微成像 (a) 細胞成像的明場圖；(b) 細胞成像熒光圖；(c) 加入100 μM Hg²⁺的細胞成像熒光圖；標尺為200 μm

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。

實施例1、一種碳量子點的制備方法：

首先將1 g的檸檬酸三鈉與2 g的尿素放入到不銹鋼反應釜中，再向其中加入10-15 mL的二甲基甲酰胺，將混合物加熱至160°C，反應進行約6 h之后，將混合溶液冷卻到室溫，在約8000轉的條件下離心約10 min，去除上清液將固體沉淀烘干得到熒光碳量子點粉末。

所制得的熒光碳量子點粉末在紫外光源下呈現綠色光發射，其熒光光譜，在420 nm的波長下激發，熒光碳量子點在530 nm有強的發射峰（附圖1），插圖對應日光燈與紫外光下的碳量子點粉末照片。熒光碳量子點溶液在370 nm的激發下，發射峰在446 nm處熒光強度最強，紫外吸收光譜中可以看出它的特征峰在346 nm左右（附圖2），附圖3a是碳量子點透射電鏡圖片，插圖為高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）圖，碳量子點的晶面間距約為0.21 nm，是典型石墨相（100）晶面，粒徑大小平均為3.52 nm（附圖3b）。

實施例2、所述合成的熒光碳量子點溶液通過熒光檢測的方法應用于環境水樣中：

熒光碳量子點作為探針檢測Hg²⁺的過程中，待測的樣品與C-dots熒光檢測探針按體積比為1:1的量混合，即150 μL的Hg²⁺的溶液樣品加入150 μL C-dots熒光檢測探針中，所有的靈敏度實驗和選擇性實驗都按以上的比例進行，具體實驗過程如下：

為了證實碳量子點溶液作為熒光探針檢測Hg²⁺的實用性，我們采集了實際環境中的水樣，如取校園中的淡水湖的樣品進行測試，通過0.2 μm隔膜過濾，然后將湖水配制不同濃度（0.001-100 μM）的Hg²⁺溶液及其它金屬離子溶液進行測試，附圖6a為碳量子點溶液與不同濃度Hg²⁺的混合的熒光光譜圖，可以看出隨著Hg²⁺濃度的增加，碳量子點溶液的熒光強度逐漸降低，附圖6b為對應紫外燈下的熒光照片。附圖7a是利用碳量子點溶液進行湖水選擇性檢測，從熒光光譜圖中，我們可以觀察到含有Hg²⁺的碳量子點溶液的熒光強度大幅度下降。附圖7b為碳量子點溶液中加入各離子后的熒光強度與碳量子點溶液熒光強度的比，也能看出熒光探針對Hg²⁺的專一性。附圖7c是相對應的紫外光源下的熒光照片。

通過以上實驗說明湖水中可能存在一些未知的物質，但對碳量子點溶液檢測探針影響不大，仍可以達到我們對Hg²⁺的檢測目的，所以可以將此種檢測方法運用到日常生活中。

實施例3、所述合成的熒光碳量子點粉末用于指紋的識別：

首先用瑪瑙研缽將碳量子點固體研磨成粉末狀，然后準備好干凈的硅片，將手指在硅片上按上指紋，用抖顯法將粉末借助紙槽散在印有潛指紋的樣品上并輕輕磕樣品載體硅片，將碳量子點粉末回收到起來，有指紋樣品的區域由于指紋汗液成分中的皮脂等對碳量子點粉末有一定的吸附作用，殘留在潛指紋表面 的碳量子點粉末會顯現出清晰的指紋圖像，可重復幾次，然后在紫外燈下觀察。附圖8是熒光碳量子點粉末顯示過的潛指紋成像照片，從中可以看出在紫外光激發下顯現后的潛指紋可以發射出明亮的綠色熒光，指紋紋路清晰連貫且與基底反差明顯。原因是潛指紋中的某些有機組分，例如油脂與碳量子點外圍的胺端基發生了靜電吸附或者胺解反應使得碳量子點靶向結合在指紋的乳突紋上。光致發光技術提高了潛指紋的顯現靈敏度， 其顯出的指紋清晰、與背景之間的反差好。指紋具有人各不同，在法庭科學和刑事訴訟過程中，起著重要的證據作用。因此，科學正確地發現、提取、顯現鑒定指紋對于開展偵查工作、懲治犯罪具有重要的實踐作用，具有良好的應用前景。

實施例4、所述合成的熒光碳量子點用于細胞熒光成像：

我們所合成的熒光碳量子點具有較強的綠色熒光、粒子較小、穩定性高、很好的相容性，所以可以將其應用到細胞成像實驗中。附圖9a所示，將溫度控制在37°C，在含有5%CO₂的加濕培養箱中，用含有10%牛血清和100 μg/mL的青霉素的培養基培養HeLa細胞。然后，將HeLa細胞接種到6孔板中與培養基進行培養24 h，接著將濃度為1 mg/mL碳量子點溶液加入到孔板中，繼續放在加濕培養箱中培養3 h后移除培養基，用PH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液將細胞洗滌3次，放到熒光顯微鏡下（加藍色濾光片）拍攝熒光照片，細胞內出現明顯的橙黃色熒光如附圖9b所示。

在碳量子點熒光探針檢測水溶液中的Hg²⁺的基礎上，我們探究了利用碳量子點通過活細胞熒光標記成像的方法檢測細胞內的Hg²⁺。向整個細胞體系中加入100 μM Hg²⁺之后，觀察細胞熒光成像變化如附圖9c所示，可以明顯的看到細胞內的熒光亮度發生了明顯的減弱現象，說明碳量子點在活的細胞內仍然能對Hg²⁺實現高效的檢測，從而證明了該熒光探針有望被應用于活的生物體內或細胞內的Hg²⁺檢測。