基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米材料、其制備方法及其應用與流程

本發明屬于生物醫用材料領域，具體涉及一種基于二氧化硅的熒光納米材料、其制備方法及其在活體熒光成像中的應用。

背景技術：

惡性腫瘤的死亡率逐年攀升，是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。調查顯示中國每年大約有200萬的新發病例，130萬人死于惡性腫瘤，是目前中國人的第二大主要死因。目前癌癥的治療方法有多種，包括手術切除、化療及放射治療等等。其中手術切除主要是依靠醫生多年的臨床實踐經驗，但是經驗對于癌癥邊界的判斷存在很大的誤差和局限性。因此如何精準的定位癌癥邊界是手術成功的關鍵，而且微小病灶的發現也有利于癌癥的有效消除，減少復發的可能性。

光學成像診斷優點突出，它對人體無損、無創、無電離輻射、設備體積小，便于攜帶，且成像迅速，靈敏度較高。為了提高熒光成像的分辨率和對比度，一種診斷輔助試劑——熒光染料被引入。傳統的熒光染料主要是小分子，其在體內成非特異性分布，僅能對血管或某些特定器官進行成像，限制了其在疾病診斷中的應用。隨著納米技術及熒光成像設備的發展，近年來，光學成像中的激發熒光成像在腫瘤邊界以及術中導航領域獲得了越來越廣泛的應用。然而目前激發熒光在術中導航中的應用大都限于淺表腫瘤如乳腺癌，其在一些內部腫瘤的應用報道極少。這主要是由于激發熒光成像背景噪聲大，成像靈敏度低等原因造成的，從而使得癌癥的診斷及治療不夠精準。為了改善這一現狀。研究人員對熒光染料進行修飾，其主要采取的技術就是物理包埋以及化學鍵連到納米粒子上，雖然在一定程度上增加了熒光染料在腫瘤部位的富集，然而眾所周知多數熒光染料在聚集狀態下其熒光會發生一定程度的淬滅，所以上述方法并不能有效提高腫瘤部位的熒光強度。因此如何提高腫瘤部位的熒光強度，降低背景噪聲是目前熒光成像技術中亟待解決的問題。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的主要目的是為了解決現有熒光染料存在的穩定性差以及體內非特異性分布的缺點，而提供了基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米材料的制備方法及應用。

為了實現上述目的，作為本發明的一個方面，本發明提供了一種基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米材料，所述熒光納米材料的粒徑在30-200nm范圍之間；以及

所述熒光納米材料的內核為二氧化硅納米粒子，所述二氧化硅納米粒子的表面通過對pH敏感的化學鍵與熒光染料連接。

作為本發明的另一個方面，本發明還提供了一種基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米材料的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，將乙醇、氨水、去離子水混合，在30℃條件下攪拌0.5～1h；

步驟2，迅速加入硅烷試劑，繼續劇烈機械攪拌15min～24h，反應結束后離心洗滌，將固體產物分散在乙醇中，由此得到二氧化硅納米粒子；

步驟3，將熒光染料分散在二甲基亞砜中，滴加到步驟2制備得到的二氧化硅納米粒子中，根據需要加入不同的催化劑進行反應0-24h，分離純化得最終產物。

作為優選，該制備方法還包括：

步驟4，將步驟3的最終產物分散到去離子水或pH為7.4的磷酸緩沖鹽溶液中，通過EDC/NHS反應將靶分子連接到所述最終產物的表面。

作為本發明的再一個方面，本發明還提供了一種如上所述的基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米材料在活體熒光成像中的應用。

基于上述技術方案可知，本發明的方法和由此制備的熒光納米材料具有如下有益效果：本發明所涉及的原料廉價，反應條件溫和，具有較強的可操作性以及可控性；制備的熒光納米材料粒徑均勻可控，具有很好的穩定性，其在循環過程中不產生熒光或者僅發出十分微弱的熒光，而在弱酸性環境中發出強烈熒光，從而起到對比增強的效果，這主要是由于在中性pH條件下染料分子連接在納米粒子表面處于聚集狀態熒光發生淬滅，而在弱酸性環境中染料與納米粒子間化學鍵發生斷裂，染料游離出來，從而顯示出強烈的熒光，因此其在病變組織熒光成像以及與其他成像模式或治療模式相結合的領域具有較好的應用前景；本發明工藝簡單，生成效率高，易于實現大規模生產且具有很好的臨床應用潛力。

附圖說明

圖1為本發明的制備方法示意圖；

圖2為本發明以帶氨基的Cy7熒光染料為例的納米粒子的掃描電鏡圖；

圖3為本發明以帶氨基的Cy7熒光染料為例的納米粒子的熒光發射光譜圖；

圖4為本發明以帶氨基的Cy7熒光染料為例的納米粒子的粒徑分布圖。

具體實施方式

為了更清楚的說明本發明，下面結合優選實施例和附圖對本發明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應當以此限制本發明的保護范圍。

本發明為了解決現有熒光染料存在的穩定性差以及體內非特異性分布的缺點，而提供了一種基于二氧化硅的熒光納米材料、其制備方法及其應用。本發明是通過化學反應在二氧化硅納米粒子的表面通過pH敏感的化學鍵將熒光染料連接到其表面制備得到基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米材料并將其應用于生物醫學領域。本發明的二氧化硅納米粒子可以通過改變原料成分，使得其表面帶有一些易于修飾的活性基團，比如氨基、羥基、羧基等等；制備得到的二氧化硅納米粒子具有穩定性好、粒徑均一可控、低毒，且活體熒光顯像對比度高等優點，在病變組織熒光成像領域具有很好的臨床應用價值。

更具體地，本發明公開了一種基于二氧化硅的熒光納米材料的制備方法，包括以下步驟：

步驟1：將乙醇、氨水、去離子水按照一定比例混合于容器，例如燒瓶中，在30℃下攪拌0.5～1h；

步驟2：迅速加入一定體積的硅烷試劑，繼續劇烈攪拌15min～24h，反應結束后離心洗滌，例如在10000rpm下離心，用乙醇洗滌三次，最后超聲分散在乙醇中；

步驟3：將熒光染料分散在二甲基亞砜(DMSO)中，滴加到制備得到的二氧化硅納米粒子中，根據需要加入不同的催化劑進行反應0-24h，最終通過離心或透析或超濾的方法除去游離的染料，并將粒子分散到去離子水或pH為7.4的磷酸緩沖鹽溶液中；

步驟4：通過EDC/NHS反應將靶分子連接到納米粒子的表面，即得到所需的基于二氧化硅的熒光納米材料。

其中，靶分子包括小分子以及抗體類靶分子。

上述反應中，可以通過改變乙醇、氨水、去離子水以及硅烷試劑的比例以及反應時間來調節納米材料的粒徑。

上述反應中，熒光染料選自熒光素類、羅丹明類、花青素類、碳菁類熒光染料中的一種或多種，例如帶氨基的Cy7熒光染料等。

上述反應中，對pH敏感的化學鍵可以選自亞胺鍵、馬來酸二甲酯鍵、腙鍵、肟鍵、酰腙鍵、縮醛/縮酮鍵、原酸酯鍵中的一種或多種。可以通過精細有機合成路線設計方法在二氧化硅納米粒子與熒光染料之間形成上述化學鍵，對于上述帶氨基的Cy7熒光染料例如通過添加酸、堿進行反應得到上述化學鍵。

上述反應中，反應條件溫和，連接靶分子之后能夠增加納米粒子的靶向性，增加其在靶組織的富集，增加靶組織與正常組織之間的對比度。

上述反應中，通過改變熒光分子在二氧化硅表面的密度，使得染料發生熒光淬滅，當且僅當納米材料達到靶組并進入細胞溶酶體或內涵體之后pH敏感的化學鍵發生斷裂才會發出強烈的熒光。

本發明還公開了一種通過上述制備方法制備得到的基于二氧化硅的熒光納米材料。

本發明還公開了一種基于二氧化硅的熒光納米材料在制備活體熒光成像顯影劑中的應用，從而對病灶組織進行診斷。

下面結合具體優選實施例對本發明的技術方案和效果做進一步的說明。需要說明的是，以下的具體實施方式只是舉例說明，本發明的技術方案并不限于以下所列舉的具體實施方式，還可以是各種實施方式之間的任意組合。

此外，為了描述的清楚，將實施例1-36的差異對比放于表1中，實施例37-108如后所述只是步驟(5)中的不同，為了節約篇幅未在表1中展現。

實施例1

(1)量取330mL乙醇、8mL氨水與110mL去離子水在圓底燒瓶中混合，在30℃條件下攪拌0.5h；

(2)量取20mL的正硅酸乙酯以及氨基丙基三乙氧基硅烷混合物(兩者的體積比為9∶1～0∶10)迅速加入到步驟(1)中的混合溶液中，繼續強烈地機械攪拌15min，反應結束后離心(10 000rpm，10min)，并用乙醇和去離子水分別洗滌2-3次；

(3)將得到的表面帶有氨基的二氧化硅納米粒子分散在pH為8.0的磷酸鹽緩沖液，含氨基的熒光染料分散在DMSO溶液中，按照氨基摩爾比10∶1～2∶1的比例將溶液混合，室溫避光磁力攪拌0.5h；

(4)50μL0.25％戊二醛溶液滴加到步驟(3)中的混合溶液中，繼續攪拌反應12h；

(5)最后將反應溶液10000rpm離心10min，并用去離子水洗滌三次。

實施例2：

(1)量取330mL乙醇、8mL氨水與110mL去離子水在圓底燒瓶中混合，在30℃條件下攪拌0.5h；

(2)量取20mL的正硅酸乙酯以及氨基丙基三乙氧基硅烷混合物(兩者的體積比為9∶1～0∶10)迅速加入到步驟(1)中的混合溶液中，繼續強烈地機械攪拌15min，反應結束后離心(10 000rpm，10min)，并用乙醇和去離子水分別洗滌2-3次；

(3)將得到的表面帶有氨基的二氧化硅納米粒子分散在pH8.0的磷酸鹽緩沖液，含醛基的熒光染料分散在DMSO溶液中，按照氨基∶醛基摩爾比10∶1～2∶1的比例將溶液混合，室溫避光磁力攪拌反應24h；

(4)最后將反應溶液10 000rpm離心10min，并用去離子水洗滌三次。

實施例3：

(1)量取330mL乙醇、8mL氨水與110mL去離子水在圓底燒瓶中混合，在30℃條件下攪拌0.5h；

(2)量取20mL的正硅酸乙酯以及氨基丙基三乙氧基硅烷混合物(兩者的體積比為9∶1～0∶10)迅速加入到步驟(1)中的混合溶液中，繼續強烈地機械攪拌15min，反應結束后離心(10 000rpm，10min)，并用乙醇和去離子水分別洗滌2-3次；

(3)將得到的表面帶有氨基的二氧化硅納米粒子分散在pH為8.0的磷酸鹽緩沖液，含羰基的熒光染料分散在DMSO溶液中，按照氨基摩爾比10∶1～2∶1的比例將溶液混合，磁力攪拌室溫混合0.5h；

(4)4倍羰基當量的DCC加入到上去混合溶液中，繼續避光攪拌反應24h；

(5)最后將反應溶液10 000rpm離心10min，并用去離子水洗滌三次。

實施例4-6：

同具體實施方式1-3，不同之處僅在于，步驟(2)中加入的正硅酸乙酯部分替換為聚乙二醇修飾的硅烷試劑，結果相似。

實施例7-36：

同實施例1-6不同之處僅在于，在步驟(2)中將氨基丙基三乙氧基硅烷替換為氨基丙基三甲氧基硅烷、氨基甲基三甲基硅烷、3-氨基丙基二(三甲基硅氧基)甲基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三(甲氧基乙氧基乙氧基)硅烷中的一種或幾種代替，結果相似。

實施例37-108：

同實施例1-36不同之處僅在于，在步驟(5)之后，按照氨基：NHS活化的抗體(實施例37-72)或小分子類靶分子(實施例73-108)摩爾比1∶1～100∶1的比例加入活化的靶分子，得到靶向性的基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米粒子。

表1

以上所述的具體實施例，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施例而已，并不用于限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。