一種具有單電子結構的自旋標記熒光探針及應用的制作方法

本發明涉及一種具有單電子結構的自旋標記熒光探針及應用，具體涉及一種針對羥基自由基、巰基自由基、細胞氧化還原環境的檢測以及多酚類抗氧化劑的抗氧化性能評價的熒光分析體系。

背景技術：

眾所周知，生物體是極其復雜的系統，而細胞內氧化還原狀態的平衡，對維持生物體細胞內的正常生理功能極為重要。研究表明，細胞氧化還原環境的改變與一系列的疾病關系密切，如癌癥、缺血再灌注損傷以及神經退化疾病如阿爾茨海默病等。因此，監測細胞氧化還原環境的動態變化可以為臨床醫學等領域提供豐富的生理、病理信息。

細胞內的氧化還原狀態平衡是通過控制細胞內還原性物質(酶類、谷胱甘肽等)和氧化性物質(活性氧、活性氮)的量，使這二者之間達到相對平衡來實現。一方面，活性氧、活性氮若在體內過度產生，將會導致“氧化應激”，產生的活性氧、活性氮超過機體的承受能力，會對機體產生氧化損傷，影響正常生理功能。比如，長期被輻射就會導致活性氧的大量增加，進而引發自由基鏈反應導致機體損傷。尤其是羥基自由基，被認為是氧化能力最強的自由基，它在細胞和組織內產生而且能夠進攻產生位置的蛋白質和糖類導致其分解、脂質的過氧化和DNA的損傷。因此，如果能夠實時在線的監測羥基自由基，就能夠更好地研究其產生以及細胞損傷機制，設計一種有效的自由基檢測方法是目前生物學、化學界研究的熱點。發展高選擇性、高靈敏度、具有生物兼容性的自由基檢測方法是更加詳細地了解自由基造成的細胞氧化損傷、誘導細胞凋亡作用機制的關鍵。另一方面，當活性氧在體內過度產生，還原性物質也會表達過多，產生還原應激，也會導致機體發生病變。如谷胱甘肽作為細胞內含量最高的小分子硫醇，是細胞內重要的還原性物質，能夠有效的清除細胞內各種有害的自由基，然而產生過量谷胱甘肽自由基(GS·)因其強氧化性可以與蛋白質硫醇以及不飽和脂肪鏈發生反應而對細胞產生毒性，從而產生還原應激，因此，阻斷GS·引發的二級氧化反應破壞其他細胞組分具有重要作用。

此外，由于人類所接觸的各種輻射，如紫外輻射，電磁輻射等日益嚴重，由此導致的各種疾病如癌癥，心血管疾病等發生率越來越高，因而天然抗氧化劑或人工抗氧化劑也受到越來越廣泛的關注。因此尋求更簡便，能對抗氧化劑性能進行比較研究的新方法，對抗氧化劑的修飾、優化、篩選以及食品或飲料等抗氧化性能評價具有重要意義。

技術實現要素：

針對上述現有技術，本發明的目的就是提供一種用于羥基自由基、巰基自由基、細胞氧化還原環境的檢測以及多酚類抗氧化劑的抗氧化性能評價的新型自旋標記熒光探針，該探針對于羥基自由基和谷胱甘肽自由基的具有靈敏度高、選擇性好、產物簡單且易于分離等特點；將該探針應用于細胞氧化還原環境檢測，具有簡便、選擇性好、靈敏度高等特點；此外，該探針對于多酚類化合物抗氧化性能評價具有良好的選擇區分性。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種具有單電子結構的自旋標記熒光探針，是通過以下方法制備得到的：

(1)將羅丹明B和4-羥基-2,2,6,6,-四甲基-哌啶氮氧自由基加入到反應溶劑二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(作為催化劑)，反應20分鐘，再加入N,N'-二環己基碳二亞胺(作為脫水劑)，氬氣保護下室溫反應24h；

所述羅丹明B、4-羥基-2,2,6,6,-四甲基-哌啶氮氧自由基、4-二甲氨基吡啶、N,N'-二環己基碳二亞胺四者的摩爾比為1:1:0.1:1；

(2)上述反應結束后，除去溶劑(減壓旋轉蒸發，加熱溫度低于50℃)，將剩余的物料進行柱色譜分離：以二氯甲烷/甲醇＝20/1(v/v)為洗脫劑，200目中性氧化鋁為固定相，收集洗脫液，除去洗脫劑(旋轉蒸發)，得紫紅色固體，即為具有單電子結構的自旋標記熒光探針。

所述具有單電子結構的自旋標記熒光探針，細胞滲透性好，細胞毒性低，可以用于細胞內羥基自由基、巰基自由基、細胞氧化還原環境的檢測，以及多酚類抗氧化劑的抗氧化性能評價研究，具體應用時，方法如下：

一種利用具有單電子結構的自旋標記熒光探針檢測細胞內羥基自由基的方法，如下：首先，用魚藤酮刺激待檢測細胞；然后，將刺激后的待檢測細胞在濃度為0.5％(質量百分數)的DMSO溶液(二甲基亞砜溶液)中孵育30min，然后加入探針，繼續培養2h，進行熒光檢測及成像；判斷：若檢測出熒光，則表明待檢測細胞內具有羥基自由基，若未檢測到熒光，則表明待檢測細胞內不具有羥基自由基。

優選的，所述用魚藤酮刺激待檢測細胞的具體方式為：用1μM魚藤酮預處理待檢測細胞30min。魚藤酮是呼吸鏈中復合酶Ⅰ的抑制劑，會導致活性氧的過量產生，由于魚藤酮的細胞毒性大，低濃度即可引起細胞凋亡等異常現象。本發明采用1μM魚藤酮對細胞處理未發現細胞形態異常變化及細胞凋亡等現象。

優選的，所述加入的探針的濃度為1μM。

進一步地，還可設置陽性對照，以羥基自由基作為陽性對照。

所述羥基自由基(體外)是通過經典的Fenton體系制備的，即：過氧化氫在亞鐵離子催化([Fe²⁺]/[H₂O₂]＝1:6)下產生羥基自由基。

所述待檢測細胞可以是各種病變細胞(比如肝癌細胞)，也可以是正常細胞(可以作為陰性對照)。

一種利用具有單電子結構的自旋標記熒光探針檢測體外羥基自由基的方法，如下：將探針加入含有濃度為1％(質量百分數)的DMSO溶液的待檢測物(此處的1％指的是DMSO溶液的濃度)中，反應30min，進行熒光檢測及成像；判斷：若檢測出熒光，則表明待檢測物中具有羥基自由基，若未檢測到熒光，則表明待檢測物中不具有羥基自由基。

優選的，所述加入的探針的濃度為5μM，檢測羥基自由基的濃度范圍為0～100μM。

一種利用具有單電子結構的自旋標記熒光探針檢測巰基自由基的方法，如下：將探針加入待檢測細胞或待檢測物中，預處理10min后，進行熒光檢測及成像；判斷：若檢測出熒光，則表明待檢測細胞內或待檢測物中具有巰基自由基，若未檢測到熒光，則表明待檢測細胞內或待檢測物中不具有巰基自由基。

所述探針的濃度為2～5μM。

檢測巰基自由基的原理為：探針捕獲谷胱甘肽自由基生成相應的熒光衍生物。體外谷胱甘肽自由基的生成方法采用辣根過氧化物酶在過氧化氫存在的條件下氧化苯酚生成苯氧自由基，進而氧化谷胱甘肽生成谷胱甘肽自由基。

一種利用具有單電子結構的自旋標記熒光探針檢測細胞內氧化還原環境的方法，如下：將細胞經10mM脫氧葡萄糖處理4h后，再與探針孵育2h，進行熒光檢測及成像；判斷：若細胞熒光強度減弱，則表明細胞總還原能力下降，細胞處于氧化應激狀態。

所述探針的濃度為2～5μM。

一種利用具有單電子結構的自旋標記熒光探針檢測多酚化合物的方法，如下：將探針加入待檢測細胞或待檢測物中，孵育2h后，進行熒光檢測及紫外光譜檢測；判斷：若檢測出熒光，則表明待檢測細胞內或待檢測物中具有多酚化合物，若未檢測到熒光，則表明待檢測細胞內或待檢測物中不具有多酚化合物。

所述探針的濃度為2～10μM。

檢測多酚化合物的原理為：多酚類抗氧化劑中酚羥基向探針提供氫原子使之轉化為抗磁性羥胺形式，從而使熒光恢復增強。

本發明的具有單電子結構的自旋標記熒光探針具有以下優點：

1.合成路線簡單，只需一步酯化反應即可得到產物。

2.反應原料經濟，反應條件溫和，在室溫下攪拌24h即可。

3.所制備化合物細胞滲透性好，細胞毒性低。

4.可用于細胞內羥基自由基、巰基自由基、細胞氧化還原環境的檢測以及多酚類抗氧化劑的抗氧化性能評價研究。

附圖說明

圖1：反應前后探針激發、發射光譜，1、3分別為反應前后激發光譜，2、4為反應前后發射光譜。反應條件：探針7.5μM，[Fe²⁺]＝100μM，DMSO 1％，[Fe²⁺]/[H₂O₂]＝1:6，反應30min；肝癌細胞和正常細胞經魚藤酮刺激產生羥基自由基成像檢測(探針1μM)。a、b分別為肝癌細胞未經魚藤酮和經魚藤酮(1μM)預先處理30min，加入探針培養2h后成像；c、d為正常細胞如a、b同樣處理；e、f、g、h分別為相應明場成像圖片。

圖2：反應前后探針發射光譜，1、2分別為反應前后發射光譜。反應條件：探針5μM，苯酚20μM，谷胱甘肽5μM，過氧化氫5μM，辣根過氧化物酶0.0625U/mL，反應時間10min；HL-60細胞內谷胱甘肽自由基成像檢測(探針2μM)。a為探針單獨與細胞孵育10min；b為細胞與探針孵育后，加入苯酚10μM、過氧化氫2μM孵育10min；c為細胞預先與N-乙基馬來酰亞胺孵育10min之后加入苯酚10μM、過氧化氫2μM孵育10min；d、e、f分別為相應明場成像圖片。

圖3：探針(2.5μM)與抗壞血酸(25μM)反應前后熒光光譜變化。1、3為反應前、后激發光譜；2、4為反應前、后發射光譜。細胞成像監測脫氧葡萄糖對細胞氧化還原環境的影響。a、肝癌細胞與4μM探針孵育2h；b、肝癌細胞經10mM脫氧葡萄糖處理4h后再與4μM探針孵育2h；c、d為正常細胞分別如同a、b一樣處理；e、f、g、h分別為相應的明場成像圖片。

圖4：HPLC-UV/Vis(550nm)檢測：水溶性維生素E(0,1,2,4,10,20mM)與20μM探針反應。峰a、b保留時間15.6、19.5min。B圖為峰a、峰b的積分面積(紅色、黑色代表峰b、峰a)。C圖為自由基清除率(紅色(A₀-A_a)/A₀，黑色A_b/A₀，A₀＝A_a+A_b)；HPLC條件：流動相甲醇/0.01M醋酸銨(90/10，V/V)；流速1.0mL/min；進樣體積20μL；柱溫25℃；色譜柱octadecyl silica(C18)。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明。

下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有 的常規儀器、試劑、材料等，可通過正規商業途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規實驗方法，檢測方法等。

實施例1：自旋標記熒光探針的合成

步驟如下：

(1)將羅丹明B(0.27mmol)和等摩爾量的4-羥基-2,2,6,6,-四甲基-哌啶氮氧自由基加入到反應溶劑10mL二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(0.027mmol)(作為催化劑)，攪拌反應20分鐘，再加入N,N'-二環己基碳二亞胺(0.27mmol)(作為脫水劑)，氬氣保護下室溫反應24h。

(2)在減壓下旋轉蒸發除去溶劑，加熱溫度低于50℃。

(3)以二氯甲烷/甲醇＝20/1(v/v)為洗脫劑，200目中性氧化鋁為固定相，進行柱色譜分離；溶劑旋干，得紫紅色固體，即為自旋標記熒光探針。

實施例2：細胞內羥基自由基的檢測實驗

體外羥基自由基生成方法采用經典的Fenton體系，即過氧化氫在亞鐵離子催化([Fe²⁺]/[H₂O₂]＝1:6)下產生，羥基自由在乙腈中被DMSO(1％)捕獲生成相對穩定的甲基自由基，與探針結合生成穩定的產物，從而導致熒光恢復達到檢測的目的。在羥基自由基檢測試劑中，探針的濃度為7.5μM，羥基自由基濃度為0-100μM。并且探針在DMSO存在的條件下對于羥基自由基具有良好的選擇性。細胞產生羥基自由基的檢測選用魚藤酮來對細胞進行刺激，并對肝癌細胞和正常細胞進行對比研究。在細胞內羥基自由基檢測試劑中，細胞經魚藤酮1μM預處理30min后，孵育0.5％DMSO，加入探針濃度為1μM培養2h后成像。

體外和細胞內羥基自由基檢測結果見附圖1和附圖說明。探針在反應前后熒光強度很弱(如激發、發射光譜1、2所示)，而在與Fenton體系產生的羥基自由基(DMSO共存)反應后熒光強度明顯增強(如激發、發射光譜3、4所示)。細胞內羥基自由基檢測，如圖所示，肝癌細胞經魚藤酮處理(b)相比空白(a)熒光強度明顯增強，這可能與魚藤酮抑制線粒體呼吸鏈中復合酶Ⅰ的活性，阻斷呼吸鏈電子傳遞，從而導致活性氧的大量產生有關，而進入細胞的DMSO能夠與羥基自由基作用，從而導致探針熒光恢復增強，同理，正常肝細胞經魚藤酮處理(d)較空白對照(c)熒光也相應增強，但并沒有癌細胞那么明顯。推測魚藤酮對肝癌細胞和正常肝細胞作用程度具有差異性，對癌細胞作用更明顯，該結果對差異性調控活性氧的產生來輔助抗癌具有一定的指導意義。

實施例3：細胞內巰基自由基的檢測實驗

體外谷胱甘肽自由基的生成方法采用辣根過氧化物酶在過氧化氫存在的條件下氧化苯酚生成苯氧自由基，進而氧化谷胱甘肽生成谷胱甘肽自由基，進而探針捕獲谷胱甘肽自由基生成相應的熒光衍生物。在體外谷胱甘肽自由基檢測試劑中，探針5μM，與苯酚20μM、谷胱甘肽5μM、過氧化氫5μM和辣根過氧化物酶0.0625U/mL在10mM(pH 7.4)的磷酸鹽緩沖溶液中反應10min。細胞產生谷胱甘肽自由基的檢測選用富含髓過氧化物酶的HL-60細胞，在細胞內谷胱甘肽自由基檢測試劑中，細胞與探針2μM預處理10min后，與苯酚10μM和過氧化氫2μM孵育10min后成像。細胞與N-乙基馬來酰亞胺預處理10min之后，熒光明顯受到抑制，證實谷胱甘肽自由基的存在。

體外和細胞內谷胱甘肽自由基檢測結果見附圖2和附圖說明。探針在反應前后熒光強度很弱(如發射光譜1所示)，而在與辣根過氧化物酶催化體系產生的谷胱甘肽自由基作用后熒光強度明顯增強(如發射光譜2所示)。HL-60細胞內谷胱甘肽自由基檢測，如圖所示，單獨探針(a)與HL-60細胞孵育后并無明顯熒光，而將苯酚和過氧化氫同時加入細胞中孵育后(b)熒光明顯增強，相反，加入巰基捕獲劑N-乙基馬來酰亞胺處理后，熒光明顯得到抑制，該探針能夠成功檢測細胞內谷胱甘肽自由基，并阻斷細胞內谷胱甘肽清除活性氧自由基產生的二級有害谷胱甘肽自由基進一步氧化細胞內重要活性分子。

實施例4：細胞內氧化還原環境的檢測實驗

脫氧葡萄糖是葡萄糖抑制劑，減少還原性物質NADPH以及丙酮酸等的產生，使細胞處于氧化狀態，采用探針熒光成像的方法對脫氧葡萄糖引起的肝癌細胞與正常肝細胞氧化還原環境的變化進行監測。在細胞氧化還原環境檢測試劑中，加入10mM脫氧葡萄糖處理細胞4h后再與2μM探針孵育2h。

細胞內氧化還原環境的檢測結果見附圖3和附圖說明。探針在反應前，熒光強度很弱(如1、2激發、發射光譜所示)，而經還原性物質(抗壞血酸)還原后，熒光強度明顯增強(如3、4激發發射光譜所示)，以上結果充分說明探針對生物還原性物質的響應。進肝癌細胞一步探針對于細胞內氧化還原環境監測，如圖所示，肝癌細胞經10mM脫氧葡萄糖處理(b)與未經脫氧葡萄糖處理(a)相比，熒光強度明顯減弱，證實脫氧葡萄糖抑制肝癌細胞中葡萄糖代謝，使其葡萄糖代謝產生的一系列還原性物質減少，進而細胞總還原能力下降，探針由于還原導致的熒光恢復減弱。與肝癌細胞不同的是，正常肝細胞經10mM脫氧葡萄糖處理后(d)與未經處理(c)相比，并沒有明顯的熒光強度變化。結果表明，脫氧葡萄糖對肝癌細胞氧化還原環境影響明顯而對正常肝細胞影響較弱。該方法在生物學中具有廣泛的應用前景，可以用于監控選擇性調控癌細胞氧化還原環境而 對正常細胞影響小的藥物，如脫氧葡萄糖等的抗癌輔助治療效果，即通過藥物作用過程中細胞氧化還原環境的變化實現實時監控。

實施例5：探針針對多酚類化合物的抗氧化性能研究

多酚類抗氧化劑中酚羥基向探針提供氫原子使之轉化為抗磁性羥胺形式，從而使熒光恢復增強。在色譜級甲醇溶液中，10μM探針與0-20mM水溶性維生素E室溫下反應2h后，進行熒光和紫外光譜檢測。為進一步對反應產物進行確認，采用液相-質譜聯用對反應產物進行確認，通過色譜峰面積來考察不同濃度水溶性維生素E與探針反應時的自由基清除率，根據計算公式：A_b/(A_a+A_b)得到甲醇體系中，水溶性維生素E、槲皮素、兒茶素、木犀草素的抗氧化能力次序。

多酚類化合物的抗氧化性能研究結果見附圖4和附圖說明。通過色譜峰積分面積來考察不同濃度水溶性維生素E與探針反應時的自由基清除率。如圖所示，隨著濃度增加，探針與水溶性維生素E反應產物峰面積b逐漸增大，而峰a探針峰面積逐漸減小。圖B也表明峰a和峰b的峰面積也分別呈減小和增加的趨勢，并且兩者呈互補的關系。在同一波長處分別從探針反應物與產物兩方面來檢測清除率，且由兩者所得結果具有高度吻合的特點(圖C),可作為相互印證，使檢測結果更準確。這種方法對于具有相似結構的多酚類抗氧化性能具有較好的選擇區分性，可用于天然抗氧化劑的修飾和優化篩選過程以及食品或飲料清除自由基抗氧化性能研究。

上述雖然結合實施例對本發明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護范圍以內。