神經元星形膠質細胞共培養板的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及細胞培養實驗器材，具體地說涉及一種神經元星形膠質細胞共培養板。
【背景技術】
[0002]神經元原代培養是體外研究神經系統疾病的重要手段之一，也是對神經系統損傷進行細胞分子水平研究的基礎。建立神經元和星形膠質細胞共培養模型對研究神經系統疾病，特別是星形膠質細胞在神經元發育、損傷和修復中的作用尤為重要。
[0003]目前存在的神經元和星形膠質細胞共培養的裝置主要是:傳統Banker裝置和Transwell小室。傳統的Banker法是利用烙鐵在蓋玻片上滴入四個高度約1_2 mm石錯，SP在蓋玻片上安放支持物以建立共培養體系，但該裝置不利于蓋玻片上的神經元進行下一步實驗。劉利等于《中華神經外科疾病研究雜志》2006年04期發表了 “神經元和膠質細胞共培養方法的建立”，公開了一種改進的Banker法，利用烙鐵將石錯(0.1 mm)安放在培養板的底面而不是蓋玻片上，這樣相對更容易建立共培養體系。
[0004]以上兩種方法均存在共同的缺陷:1、利用烙鐵在培養皿底部滴入石蠟，由于操作人員的關系，每次構建的體系，甚至同一批次的體系都可能會出現較大差異。2、石蠟的熔點較低(47°C -64°C)，且密度(0.9 g/cm3)低于細胞培養基，在共培養體系建立的過程中，勢必降低裝置的穩定性。3、石蠟溶于汽油、二硫化碳、二甲苯、乙醚、苯、氯仿、四氯化碳、石腦油等非極性溶劑，同時極易溶于細胞實驗常用的溶劑二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMS0)，影響共培養體系的微環境。
[0005]Transwell小室的底部濾膜材質為聚苯二甲酸乙二醇酯(polythyleneterephthalate, PET)，膜表面經過鈦酸酯偶聯劑(titanate coupling agent，TC)處理，改善了細胞的貼壁性；另外，插入式細胞培養皿包含有透明的B1pore膜，可直接透過膜觀察細胞。利用插入式培養皿可將星形膠質細胞或神經元接種于可通透性的PET膜上，直徑為12 mm和30 mm的插入式細胞培養皿可懸掛于24孔或6孔板上，其原理是將星形膠質細胞和神經元在同一培養基中的兩個層面上進行培養，星形膠質細胞和神經元分泌的各種細胞因子和營養物質可以通過插入式培養皿的微孔膜在細胞間進行交換。純化的星形膠質細胞向培養基中釋放大量的神經營養因子以供神經元生長所需，又不會阻礙神經元的生長。插入式培養皿為懸掛式設計，方便移液管操作，而且插入皿會自動歸位。但利用Transwell小室進行神經元星形膠質細胞共培養，存在以下問題=(I)Transwell小室中，生長于不同層面的神經元和星形膠質細胞通過濾膜進行對話，不符合實際生理情況。(2)尤其在共培養的短期作用觀察中，Transwell小室的濾膜在一定程度上，不利于細胞因子和營養物質的迅速擴散和相互交流，導致介質分布不均，影響細胞間對話。(3) Transwell小室費的用較貴且膜面積有限，難以應用于大規模、大批次的細胞共培養。
【實用新型內容】
[0006]發明目的:本實用新型的目的是提供一種低成本、建立培養體系簡捷有效的神經元星形膠質細胞共培養板。
[0007]技術方案:為實現上述目的，神經元星形膠質細胞共培養板包括孔板、設于孔板內底面的若干個支撐座、以及搭在若干支撐座上的爬片。
[0008]本實用新型的支撐座設置于孔板底面，方便爬片上的神經元進行進一步實驗。為了保證爬片支撐的穩定性，防止使用過程中發生晃動，所述爬片下表面設有與支撐座上端形成限位關系的淺槽。
[0009]所述支撐座為球形支撐座或柱形支撐座，優選為圓柱形支撐座。
[0010]進一步地，所述支撐座為局部熔融狀態下焊接在孔板內底面的玻璃珠或玻璃柱。[0011 ] 所述淺槽為圓形槽，位置與支撐座的分布是對應的。支撐座上端位于淺槽內，僅會在微小范圍內浮動，防止爬片在移動孔板過程中滑落。所述淺槽也可設為一體式的環形槽，熔融焊接支撐座時，根據需要焊接到孔板內底面，支撐座上端對應地環形槽內，可在一定程度上保證爬片安裝的穩定性。
[0012]優選地，對于12孔板而言，所述玻璃珠直徑為3~5 mm，相鄰玻璃珠之間距離為15-25 mm，恪融部分的高度為0.5-1.0 mm ;所述玻璃柱底面直徑為3~5 mm，高度為3~5 mm,相鄰玻璃柱之間距離為15~25 mm，熔融部分的高度為0.5~1.0 mm。6孔板、24孔板的玻璃珠、玻璃柱大小根據使用需要進行適應性調整。
[0013]本實用新型所述孔板為6孔、12孔、24孔細胞培養板或細胞培養皿中的任意一種，優選為12孔細胞培養板。
[0014]所述支撐座設有為3~6個，優選數量為4個。所述爬片形狀包括但不限于圓形或四邊形，優選為四邊形，方便爬片的取出。
[0015]利用本實用新型的培養板建立神經元和星形膠質細胞培養體系的處理步驟包括:
[0016](I)酸處理后進行高壓滅菌，然后焊接到孔板內底面；
[0017](2)冷卻后將焊接有玻璃珠或玻璃柱的孔板紫外消毒，多聚賴氨酸包被，37°C過夜；
[0018](3)將神經元種植于孔板內底面，48 h后大半量換液，以后每2?3 d換液一次；
[0019](4)神經元種植第5 d，玻璃爬片酸處理后高壓滅菌，多聚賴氨酸包被，37°C過夜；
[0020](5)離體培養10?14 d星形膠質細胞種植于爬片，24 h后全量換液，以后每2?3 d換液一次；
[0021](6)神經元種植第7 d，條件培養基預孵星形膠質細胞24 h，收集條件培養基；次日，條件培養基半量更換神經元培養基，37°C孵育24 h ;
[0022](7)神經元種植第9?10 d，更換新鮮神經元培養基，將星形膠質細胞爬片小心反扣于玻璃珠表面，建立體系。
[0023]有益效果:(I)本實用新型設計合理、操作簡便、易行，克服了傳統的Banker培養方法星形膠質細胞生長不易控制的問題，神經元和星形