一種用于檢測食品中細菌的探針和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本實用新型涉及一種檢測用的探針，具體涉及一種用于檢測食品中細菌的探針和 試劑盒。
【背景技術】
[0002] 食品細菌即指常在食品中存在的細菌，自然界的細菌種類繁多，但由于食品理化 性質，所處環境條件及加工處理等因素的限制，在食品中存在的細菌只是自然界細菌的一 小部分。食品細菌包括致病菌和非致病菌：致病菌是指隨食物進入人體后可引起食源性疾 病，常見者如沙門氏菌、志賀氏菌等，與疾病直接有關，一般規定在食品中不允許檢出。非致 病菌一般不引起人類疾病，但其中一部分為腐敗菌，如假單胞菌，與食品變質有密切關系， 是評價食品衛生質量的重要指標。
[0003] 在我國的食品衛生標準中，測定食品中細菌數量的方法，是在嚴格規定的培養方 法和培養條件下進行的，使得適應這些條件的每一個活菌細胞能夠生成一個肉眼可見的菌 落，所生成的菌落總數即是該食品中的細菌總數。食品中細菌的種類很多，它們的生理特性 和所需要的培養條件不盡相同。如果要采用培養的方法計數食品中所有的細菌種類和數 量，必須采用不同的培養基及培養條件，其工作量很大，通常會采用檢測指標菌的方法來替 代。
[0004] 例如，腸道致病菌如沙門氏菌屬和志賀氏菌屬是引起食物中毒的重要致病菌，然 而這些致病菌往往數量較少且難以培養，對食品進行逐批逐件地檢驗又不可能，鑒于大腸 菌群與腸道致病菌來源相同，而且一般在外環境中生存時間也與主要腸道病原菌一致，所 以大腸菌群通常就作為腸道病原菌污染食品的指示菌。通過檢測指標菌來大致判斷食品中 的致病菌存在狀況，不失為一種簡便方法，但很顯然，指標菌和病原菌的存在并非完成平行 的關系一一食品中檢出大腸菌群，只能說明有腸道病原菌存在的可能性，食品中未檢測大 腸菌群，也不能完全排除食品中可能有腸道病原體污染。
[0005] 由此可見，當前的食品細菌檢測方法并不能很好地滿足簡便、快速、準確的檢測需 求，對于難培養、難鑒定的食品源致病菌，需要更高效的檢測手段。 【實用新型內容】
[0006] 本實用新型的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供了一種探針，所述探 針能用于檢測食品中細菌，通過熒光原位雜交的手段，本實用新型還提供了一種快速、靈 敏、特異性地檢測食物中常見細菌的試劑盒和方法。
[0007] 為實現上述目的，所采取的技術方案：一種用于檢測食品中細菌的探針，所述探針 呈分子信標結構，即探針序列由莖、環兩部分組成，總長度25~60個堿基，其中中間的環序 列部分與細菌16srRNA或23srRNA序列相匹配，兩端莖部分是5~8個互補的DNA或PNA 序列，探針在常溫下會自動退火形成發夾結構；探針的5'端用熒光基團標記，3'端用熒光 淬滅基團標記，常態下游離的探針由于呈發夾結構，熒光基團因緊挨熒光淬滅基團，而不會 有熒光發出，只有當探針與靶序列成功雜交上之后，熒光基團和熒光淬滅基團分離開來，才 會發出熒光；
[0008] 所述探針是通過核酸雜交的原理檢測食品中的細菌的，所述細菌包括食品中正常 攜帶的細菌以及食品被污染后帶上的致病菌。
[0009] 優選地，所述探針5'端的熒光基團為FITC、FAM和Cy3中的一種，所述探針3'端 的熒光淬滅基團為DABCYL、BDH和TANRA中的一種。
[0010] 本實用新型提供了一種用于檢測食品中細菌的的試劑盒，所述試劑盒包括：
[0011] (1)上述所述的探針；
[0012] (2)重懸固定液；
[0013] (3)雜交液；
[0014] (4)洗滌液；
[0015] 所述重懸固定液包括：
[0016] Tris-HCl 50-150 mMpHB.O, DM SO 3%~10% (v/v), CaCl2 5~20mM, DEPC 0.1%~l%(v/v)， P-巰基乙醇 1%~5% (v/v)，
[0017] 曱醇 20%~45% ( v/v)。
[0018]優選地，所述雜交液包括 5% (w/v)PEG，50mMNaCl，40% (v/v)甲酰胺，0? 5% (w/ v)過硫酸按，1% (w/v)DEPC，l% (w/v)聚鹿糖，50mMEDTA，0.1% (v/v)TritonX-100,50mM pH8.0 的Tris-HCl;
[0019]所述洗滌液包括 50mMTris-HCl(pH10.0)，0.5MNaCl，0. 1% (v/v)NP-40,0.5% (v/v)TritonX-100〇
[0020] 本實用新型還提供了一種快速檢測食品中細菌的方法，所述方法采用上述所述試 劑盒來檢測，所述方法包括以下步驟：
[0021] (la)取待檢食品樣品，加入到重懸固定液中，震湯混勾；
[0022] (2a)取步驟（la)中混勻后的液體滴在載玻片上，然后烘干；
[0023] (3a)將步驟（2a)中獲得的載玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干；
[0024] (4a)在浸泡后的載玻片上的待檢位置加入雜交液和探針，置于雜交爐中避光雜 交；
[0025] (5a)將步驟（4a)中獲得的載玻片浸入預熱的洗滌液中洗滌，然后烘干；
[0026] (6a)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用10X物鏡掃視和計數，用40或100X 物鏡觀察細菌形態；
[0027] 或者所述方法包括以下步驟：
[0028](lb)取待檢食品樣品，加入到重懸固定液中，震湯混勾；
[0029] (2b)過濾得到濾液；
[0030] (3b)取步驟（2b)中得到的濾液滴在載玻片上，然后烘干；
[0031] (4b)將步驟（3b)中獲得的載玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干；
[0032] (5b)在浸泡后的載玻片上的待檢位置加入雜交液和探針，置于雜交爐中避光雜 交；
[0033] (6b)將步驟（5b)中獲得的載玻片浸入預熱的洗滌液中洗絳，然后烘干；
[0034] (7b)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用10X物鏡掃視和計數，用40或100X 物鏡觀察細菌形態。
[0035]上述所述步驟（la)、（lb)是通過重懸固定液使食品樣品中的細菌與食品成分分 開，并且使分開的細菌懸浮于重懸固定液中，上述所述步驟（2a)、（3b)是為了使待檢食品 樣品中的細菌固定在載玻片上。
[0036]優選地，所述步驟（la)、（lb)中所述待檢食品樣品與所述重懸固定液的體積比 為1:1~1:5,所述步驟（2a)中所述液體滴加的體積為10yL，所述步驟（3b)中所述濾液 滴加的體積為10UL，所述步驟（2a)、（3a)、（5a)、（3b)、（4b)、（6b)中的烘干溫度為52~ 58°C，所述步驟（3a)、（4b)中所述浸泡時間為5分鐘，所述步驟（5a)、（6b)中洗滌液的預熱 溫度為52~58°C，所述步驟（5a)、（6b)中所述洗滌時間為5~20分鐘。
[0037]優選地，所述步驟（3a)、（4b)中所述雜交液的加入體積為20yL，所述探針加入后 的濃度為20ng/L。
[0038]優選地，所述步驟（3a)、（4b)中雜交溫度為52°C，雜交時間為30分鐘。
[0039] 本實用新型所述試劑盒和檢測方法的技術要點或原理：本實用新型所述重懸固定 液可以快速將食品中的細菌與食品成分分開，并使之易于結合到載玻片上。熒光原位雜交 (FlourescenceinsituHybridization，FISH)是一種應用標記有焚光物質的探針