Lamp用加樣反應容器的制造方法
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及一種生物技術領域的實驗耗材，特別涉及LAMP實驗領域的一種加樣反應容器。
【背景技術】
[0002]2000年日本學者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開了一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術，即“環介導等溫擴增技術”，其英文名稱為LAMP (Loop-mediated isothermal amplificat1n)。短短幾年，該技術受到了世衛組織WH0、各國學者和相關政府部門的關注，該技術已成功地應用于SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測中。近十幾年，環介導等溫擴增技術已廣泛應用于日本國內各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測、食品化妝品安全檢查及進出口快速診斷中，并得到了歐美國家的認同。
[0003]LAMP技術具有如下優點:(I)靈敏度高，比傳統的PCR方法高2?5個數量級；(2)反應時間短，30?60分鐘就能完成反應；(3)無需特殊的儀器(試劑盒或實驗方法研發階段除外)；(4)操作簡單，不論是DNA還是RNA，檢測步驟均為:將反應液、酶和模板混合于反應管中，置于水浴鍋或恒溫箱中63°C左右保溫30?60分鐘，肉眼觀察結果。
[0004]由于LAMP技術特異性和靈敏度高、操作簡單且對儀器設備要求低、檢測簡單等優點，特別適合基層食品安全快速檢測、基層防疫部門和環保部門病原微生物快速檢測、醫院臨床病原微生物的快速檢測和基層科研機構或個人的研發需要等。
[0005]LAMP技術同時也存在如下缺點:⑴由于LAMP技術靈敏度高，由于目前國內大多數實驗條件所限，LAMP實驗多采用普通移液器和普通PCR管(板)或Eppendorf管等常規分子生物學耗材和設備，在配液、反應和點樣過程中，很容易造成待檢測樣本氣溶膠泄露至移液器槍管中，或因受熱導致PCR管或EP管管蓋密封不嚴導致待測樣本泄漏致水浴鍋、恒溫箱或加樣區域空氣中，帶來病原微生物等污染風險并導致后續LAMP實驗結果假陽性率升高；(2)LAMP快速檢測試劑盒的研發實驗涉及到引物的選擇，引物濃度的調整，及反應溫度和時間的優化，其實驗結果僅通過肉眼觀察定性結果是不夠的，這就需要對實驗結果進行量化分析，常用的分子生物學移液加樣方法同樣會增加病原微生物等泄露和污染風險，以及后續LAMP實驗結果假陽性風險。
[0006]針對上述不足，需要提供一種LAMP加樣反應容器，避免LAMP反應在配液和點樣過程中病原微生物等氣溶膠的泄露和污染，以及后續LAMP實驗結果假陽性風險。
【實用新型內容】
[0007]有鑒于此，本實用新型提供了一種LAMP加樣反應容器，可有效避免LAMP反應在配液和點樣過程中病原微生物等氣溶膠的泄露和污染，以及后續LAMP實驗結果假陽性風險。
[0008]本實用新型的目的是通過下述技術方案實現的:
[0009]LAMP用加樣反應容器包括加樣器和反應器兩部分，加樣器由吸帽和吸管組成，吸管兩端開口，其中一端與吸帽密封連接且相通；反應器由封閉部件、反應部分和加樣部分組成，其中反應部分的兩端為開放式結構，具有兩個開口，反應部分的一端開口與封閉部件活動連接，另一端開口與加樣部分連通，加樣器吸管能夠從與反應器封閉部件活動連接的一端開口內適配插入，將加樣器中的液體轉移至反應器反應部分和/或加樣部分內。
[0010]優選地，加樣器的吸帽為乳膠材質，為了方便觀察移液動作，避免誤操作發生，吸管選用透明或半透明材質，優選透明有機玻璃或透明塑料材質；吸管整體為圓柱形或者吸管主體為圓柱形、末端為尖嘴，其中，優選吸管末端為尖嘴的設計，因為尖嘴嘴部與接觸容器之間的接觸面積較小可有效減少掛壁；另外，為滿足LAMP常用反應體系的需要，吸帽和吸管的容積設計為30-80 μ 1
[0011]優選地，反應器反應部分包括圓柱形或圓臺形頸部和反應部，其中所述頸部與封閉部件活動連接，所述反應部與加樣部分連接。本領域技術人員可以理解，反應器封閉部件可以選用任意一種可與反應器頸部密封活動連接的部件。為確保密封效果，該封閉部件優選密封橡膠塞或密封乳膠塞等彈性部件，優選地，該封閉部件分兩層，內層為密封橡膠塞或密封乳膠塞等彈性部件，外層為鋁箔等加固部分，加固部分中央為可去除的供所述加樣器吸管順利通過的同心圓結構，加樣器吸管能夠從中適配插入并與其密封結合。使用時，只需將加固部分中央同心圓結構去除，將加樣器吸管從中適配插入將液體轉移至反應器反應部分和/或加樣部分內，同時吸管與乳膠塞等彈性部件內層同心圓結構形成密封結合，該技術方案可有效減少氣溶膠的泄露和污染。
[0012]為了增大LAMP反應液與反應部外壁接觸面積，提高LAMP反應效率，反應器反應部分外壁呈弧形，反應器選用導熱性能良好的材質，尤其是，為了方便觀察移液動作，避免誤操作發生，反應器優選透明導熱塑料或透明有機玻璃材質，另外，為滿足LAMP常用反應體系的需要，反應部分弧形反應部厚度為0.05-0.15_，體積為50-200 μ I。
[0013]優選地，反應器加樣部分分為緩沖區、刻度區、尾部，其中緩沖區、刻度區、尾部依序連接，且刻度區上設置有刻度，同時尾部的末端通過密封結構使尾部末端形成封閉式結構，避免加樣部分內的液體隨意流出。為了方便LAMP反應結束后定量檢測點樣，加樣部分軸線與反應部分頸部軸線之間夾角為θ，30° ( Θ <90°，其中，優選夾角為直角的設計，直角的設計在進行加樣時操作性更加友好。
[0014]為滿足LAMP常用反應體系的需要，加樣部分中間刻度區直徑設計為l-2mm，體積為20-50 μ I ;為了方便檢測點樣，加樣部分密封尾部于刻度終止處設有可整齊去除的磨砂環或可移除的密封蓋或密封塞。
[0015]本實用新型還公開了前述LAMP用加樣反應容器的使用方法，包括如下步驟:
[0016]I)取下反應器封閉部件，使用加樣器吸取配制好的LAMP反應液，加樣器吸管通過與反應器封閉部件活動連接的一端開口將配制好的LAMP反應液加入到反應器反應部；2)將反應器放入溫控設備中進行LAMP反應，溫控范圍60°C _65°C，反應時間15min_60min ；3)LAMP反應完畢后，將反應器加熱至94°C _100°C，滅活反應液中活性物質；4)滅活完成后，取出反應器，觀察熒光或濁度，進行定性判定；5)通過加樣器向反應器中加入2-5 μ I上樣緩沖液并混勻，通過加樣部分加樣電泳，定量分析LAMP反應產物。
[0017]采用上述加樣器取代移液器可有效解決因使用移液器所造成的在前實驗樣本氣溶膠對在后實驗的影響，有效減少在后實驗的假陽性率。
[0018]目前，實驗室LAMP反應體系構建過程中用到的標準的加樣器和反應容器組合為“移液器+吸頭+PCR反應管”，由于在配液、反應和點樣過程中，尤其是后續的電泳定量檢測操作步驟中，需要反復打