用于檢測多種呼吸道病毒的pcr引物組、探針組及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及用于檢測多種呼吸道病毒的PCR引物組、探針組及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 呼吸道感染是臨床最常見的疾病之一，可由多種病原體引起，其中包括細菌、病 毒、支原體、衣原體等。其中急性呼吸道感染(Acute Respiratory Tract Infection,ARTI) 是世界范圍內導致兒童患病和死亡的重要原因。世界衛生組織(WH0)2005年在《柳葉刀》雜 志發表文章報道:在2000-2003年，每年1060萬5歲W下死亡兒童中，因傳染性疾病死亡占 54%，其中因肺炎死亡的患兒占 19% dARTI的嚴格定義是所有的呼吸道感染，然而，實際上， 在嚴重呼吸道疾病中急性下呼吸道占據大多數，占世界范圍內學齡前兒童死亡總數的 20%，其中90%為肺炎。大量的證據表明，營養不良、低出生體重、被動吸煙、人工喂養、經濟 困難、居住環境擁擠、免疫功能缺陷、HIV感染是嚴重ARTI的危險因素，因此，大多數因急性 呼吸道感染死亡的病例發生在發展中國家。ARTI主要的致病微生物包括細菌和病毒，還包 括一些非典型病原體，如真菌、支原體、衣原體等，根據臨床癥狀和影像報告臨床工作者很 難將它們區分，因此病原分析對于臨床診斷和治療至關重要。
[0003] 傳統檢測呼吸道病原體的方法主要有培養方法、生化方法和免疫方法等，培養法 操作復雜，檢測周期長、費用高，不適合作為臨床樣品的常規檢測。生化檢測方法操作簡單、 快速，費用低，是目前口診檢驗的常規檢測方法;但該方法靈敏度和特異性不高，影響因素 多，不能區分病原體的具體種類。免疫檢測方法快速簡便;但一個檢測只能針對其中一種病 原體。
[0004] 隨著醫療水平的發展，用上述傳統的方法已經不能滿足對呼吸道病原體的檢測， 臨床上需要一種能夠靈敏、特異，并且快速、簡便的呼吸道多病原體鑒定檢測方法，W便能 夠更好的做到個體化的治療、并滿足對衛生防疫和疫情控制、進行傳染病流行病學研究的 需求。
【發明內容】
[0005] 本發明的主要目的在于提出一種準確、快速、靈敏的用于檢測多種呼吸道病毒的 PCR引物組、探針組、PCR反應液及試劑盒。
[0006] 其中，所述PCR引物組包括W下至少兩對引物對：
[0007] 由序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示的兩條序列組成的針對甲型流感病 毒的引物對；
[000引由序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的兩條序列組成的針對乙型流感病 毒的引物對；
[0009]由序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的兩條序列組成的針對呼吸道合胞 病毒的引物對；
[0010]由序列表中沈Q ID NO.7和沈Q ID NO.8所示的兩條序列組成的針對I型副流感病 毒的引物對；
[0011]由序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO. 10所示的兩條序列組成的針對II型副流感 病毒的引物對；
[00切由序列表中SEQ ID NO. 11和沈Q ID NO. 12所示的兩條序列組成的針對III型副流 感病毒的引物對；
[0013] 由序列表中SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14所示的兩條序列組成的針對冠狀病毒 的引物對；
[0014] 由序列表中SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所示的兩條序列組成的針對C型鼻病毒 的引物對；
[001引由序列表中SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 18所示的兩條序列組成的針對人偏肺病 毒的引物對。
[0016] 所述探針組包括W下至少兩條分子信標探針：
[0017] 由序列表中SEQ ID NO. 19所示的序列或其反向互補序列組成的針對甲型流感病 毒的分子信標探針；
[0018] 由序列表中SEQ ID NO. 20所示的序列或其反向互補序列組成的針對乙型流感病 毒的分子信標探針；
[0019] 由序列表中SEQ ID NO. 21所示的序列或其反向互補序列組成的針對呼吸道合胞 病毒的分子信標探針；
[0020] 由序列表中SEQ ID NO. 22所示的序列或其反向互補序列組成的針對I型副流感病 毒的分子信標探針；
[0021] 由序列表中SEQ ID NO. 23所示的序列或其反向互補序列組成的針對II型副流感 病毒的分子信標探針；
[0022] 由序列表中SEQ ID NO.24所示的序列或其反向互補序列組成的針對HI型副流感 病毒的分子信標探針；
[0023] 由序列表中SEQ ID NO. 25所示的序列或其反向互補序列組成的針對冠狀病毒的 分子信標探針；
[0024] 由序列表中SEQ ID NO. 26所示的序列或其反向互補序列組成的針對C型鼻病毒的 分子信標探針；
[0025] 由序列表中SEQ ID NO. 27所示的序列或其反向互補序列組成的針對人偏肺病毒 的分子信標探針；
[0026] 每一條分子信標探針的兩端分別帶有巧光基團和澤滅基團。
[0027] 優選地，每一條所述分子信標探針的整體為莖環結構，兩端為互補的莖結構，中間 為與對應呼吸道病毒擴增產物特異雜交的環狀結構。
[00%]優選地，每一條所述分子信標探針的烙解溫度范圍在55°C~80°C，至少兩條所述 分子信標探針中若具有相同的巧光基團，則具有相同巧光基團標記的分子信標探針的Tm設 計成一定的梯度，差異在2°C W上。
[00巧]優選地，所述巧光基團選自FAM、HEX和TAMRA，所述澤滅基團為Dabcy 1。
[0030] 其中，所述PCR反應液，包含所述的PCR引物組和對應的所述的探針組
[0031 ]所述的試劑盒包括至少一人份所述的PCR反應液。
[0032] 本發明的有益效果包括：
[0033] 采用本發明的技術方案，可W檢測并鑒別多種呼吸道病毒，而且該方法操作簡便、 檢測準確、靈敏、快速，4小時內可出結果。本發明利用多重RT-PCR巧光分子信標烙解曲線技 術，PCR擴增后直接對產物進行烙解曲線分析，無需開蓋分析，可有效避免產物污染;多色巧 光和烙解曲線相結合，保證了檢測的足夠通量，可進行多種呼吸道病毒的分型檢測，應用分 子信標探針技術，檢測的特異性高，成本較低，適合在臨床大量推廣使用。
【附圖說明】
[0034] 圖1為本發明【具體實施方式】中的甲型流感病毒(Flu-A)、乙型流感病毒(Flu-B)、呼 吸道合胞病毒(RSV)的FAM巧光烙解曲線圖；
[0035] 圖2為本發明【具體實施方式】中的I型副流感病毒(PIV-I)、II型副流感病毒(PIV-IIKIII型副流感病毒(PIV-III)的肥X巧光烙解曲線圖；
[0036] 圖3為本發明【具體實施方式】中的冠狀病毒(CoV)、C型鼻病毒(皿V-C)、人偏肺病毒 (HMPV)的TAMRA巧光烙解曲線圖。
【具體實施方式】
[0037] 本發明設及對多種呼吸道病毒分型檢測的PCR引物組、探針組、PCR反應液及試劑 盒。下面結合【具體實施方式】及附圖對本發明作進一步詳細說明。應該強調的是，下述說明僅 僅是示例性的，而不是為了限制本發明的范圍及其應用。
[003引根據本發明的實施例，對多種呼吸道病毒檢測的PCR引物組、探針組、PCR反應液及 試劑盒將用于W下9種呼吸道病毒中的至少巧巾的分型檢測，分別為：甲型流感病毒、乙型流 感病毒、呼吸道合胞病毒、I型副流感病毒、n型副流感病毒、III型副流感病毒、冠狀病毒、C 型鼻病毒和人偏肺病毒。
[0039] 在一些實施例中，可W通過RT-PCR擴增待檢者的鼻咽拭子呼吸道RNA病毒的保守 基因片段，其中PCR引物序列優選為W下表1中的至少一對：
[0040] 表 1
[0041]
[C
[0043」其中，"r表示上游引物，"R"表示下游引物。
[0044] 在一些實施例中，采用如下9條針對呼吸道病毒的分子信標探針中的至少兩條，分 子信標探針的兩端分別標記巧光基團和澤滅基團，探針序列如下表2,探針Pl~P9的序列編 號分別為沈Q ID NO. 19~沈Q ID NO.27:
[0045] 表 2
[0046]
L0047J 其中FAM、肥X、TAMRA為巧光基團，D油巧I為渾滅基團。每一余分于信標株針的烙解 溫度范圍在55°C~80°C，具有相同的巧光基團的分子信標探針的Tm設計成一定的梯度，即 差異在2°C W上。
[0048] 當然，在其他實施例中，每一條分子信標探針的巧光基團可W相同也可W不同，各 序列對應的巧光基團和澤滅基團不限于上述特定類型，且巧光基團和澤滅基團的位