一種與牙鲆數量性狀相關的snp位點、其篩選方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于水產養殖中的篩選技術領域，具體設及一種與牙解數量性狀相關的 SNP位點、其篩選方法及應用。
【背景技術】
[0002] 牙解（Paralichthys olivaceus)，又名偏口、左口、左偏、牙片等，隸屬于蝶形目 (Pleuronectiformes)，牙解科(Bothidae)，牙解屬，主要分布在俄羅斯遠東地區、日本、韓 國和我國沿海，屬于±著種類。它個體大，生長快，味道鮮美，深受東亞各國的青睞。
[0003] 體重、體長等數量性狀一直W來都是魚類育種的主要選育性狀。肌肉生長抑制素 基因(Myostatin，MSTN)作為與肌肉生長相關的候選基因成為各種動物育種研究的熱點。該 基因又稱為生長分化因子-8(GDF-8),屬于轉化生長因子PdYansforming growth factor-e，TGF-e)家族，是肌肉細胞生長的負調控因子。1997年美國化hn化pkins大學醫學院的Mc Pherron等在研究轉化生長因子e(TGF-e)時，在小鼠的骨骼肌細胞中發現并首次擴增出該 基因的cDNA。研究表明，敲除MSTN基因的小鼠肌肉是正常野生型小鼠的2~3倍，且肌肉的脂 肪含量也比較低。通過轉基因技術和RNAi技術抑制斑馬魚的MSTN基因發現試驗魚的肌肉明 顯比正常魚發達，因此認為該基因在動物肌肉生長發育中起重要的抑制作用，也可能參與 脂肪生成的調節。近年來的一些研究還發現魚類的MSTN基因可W在除肌肉外的多個組織中 表達，如腦、腸、觸、腎、性腺等，還有可能影響其他組織的發育。由于MSTN在遺傳育種上的潛 在應用價值，自其被發現W來，一直備受科研工作者的廣泛關注，目前，已克隆得到多種魚 類的MSTN基因，如斑馬魚、虹縛、大口黑驢、眼斑擬石首魚、大黃魚、加州驢、經魚、日本牙解、 斑點叉尾綱等。人們期望通過對該基因的控制來增加肌肉產量。
[0004] 鑒于MSTN在水產養殖中潛在的應用前景，本發明對牙解魚的MSTN基因在進行重測 序，篩查SNP，與數量性狀進行關聯分析，確定與數量性狀相關的SNP標記，標記可用于牙解 分子標記輔助選育。
【發明內容】
[0005] 為了解決現有技術存在的上述問題，本發明提供了一種與牙解數量性狀相關的 SNP位點、其篩選方法及應用。通過候選基因關聯分析法，對MSTN基因中SNP與牙解數量性狀 進行關聯分析，獲得了一個與數量性狀相關的SNP標記，所述SNP標記可用于牙解標記輔助 選育，縮短育種周期。
[0006] 本發明所采用的技術方案為：一種與牙解數量性狀相關的SNP位點，所述SNP位點 位于序列為SEQ ID NO: 1的MSTN基因上，包括SNPl位點、SNP2位點和SNP3位點、其中：
[0007] SNPl位點位于所述MSTN基因第2個內含子第74化P位置，其堿基為C或T;
[000引 SNP2位點位于所述MSTN基因第3個外顯子第30bp位置，其堿基為C或T;
[0009] SNP3位點位于所述MSTN基因3 ' UTR第330bp位置，其堿基為C或A。
[0010]本發明還提供了一種所述SNP位點的篩選方法，使用第一引物組和第二引物組從 所述MSTN基因中裁剪出MSTN2片段和MSTN3片段，所述SNPl位點和SNP2位點位于所述MSTN2 片段上，所述SNP3位點位于所述MSTN3片段上;所述第一引物組包括第一上游引物和第一下 游引物，所述第二引物組包括第二上游引物和第一下游引物;第一上游引物的序列如SEQ ID N0:2所示，第一下游引物的序列如SEQ ID N0:3所示，第二上游引物的序列如SEQ ID N0:4所示，第二下游引物的序列如SEQ ID N0:5所示。
[0011] 其中，SEQ ID ^:2的序列為6164414616166616〔416。
[0012] 沈Q ID 備：3的序列為4〔6(：1'押01；1'〔0：44(：1'〔4八6;
[0013] 沈Q ID 備:4的序列為〔416〔4(：176〔464461410：;
[0014] SEQ ID
[0015] 作為一種實施方式，使用第一引物組和第二引物組從所述MSTN基因中裁剪出 MSTN2片段和MSTN3片段之前，先對所述MSTN基因進行PCR擴增，在PCR擴增過程中，使用的反 應體系為：總體積為50化，DNA化L，10*buf f e巧化，Mg2+化L，dNTP化L，引物化L/條，Taq酶 0.化L，余量為水。
[0016] 在PCR擴增過程中，使用的PCR擴增程序為:在94°C溫度下預變性3min;然后進行35 個循環，其中每個循環依次包括W下步驟:在94 °C溫度下變性15s，在55°C溫度下復性15s， 在72°C溫度下延伸30s;完成35個循環之后，在72°C的溫度下延伸3min。
[0017] 本發明還提供了所述SNP位點在牙解篩選中的應用。
[0018] -種應用所述SNP位點進行牙解篩選的方法，包括W下步驟：
[0019] A、牙解篩選:根據GB/18654.3-2008中的數量性狀指標為標準，篩選得到不同的牙 解，數量性狀指標包括但不限于全長、體長和體高；
[0020] B、同池混養:將篩選后的牙解在同池中混養；
[0021] C、基因分型：一定的養殖周期后，對不同牙解的MSTN基因中所述SNP位點進行鑒 定，同時根據GB/18654.3-2008標準，測得不同牙解的數量性狀指標；
[0022] D、對不同牙解的數量性狀指標與其SNP位點的基因型進行關聯分析。
[0023] 優選的，在篩選出牙解之后，將每條牙解分別經過誘導得到不同的雌核發育家系 和/或雜合克隆家系，并對每個雌核發育家系和/或雜合克隆家系進行標記;標記完成后，將 所有家系中的牙解同池混養。每個家系中所有的個體的遺傳物質是相同的，后期只需要在 每個家系中選出少量或部分牙解個體進行分型測序即可，極大地減小了后期基因分型測序 的工作量;另外，同一家系中的數據能夠采用取平均值的方式進行數據分析處理，增加了數 據的可靠性。
[0024] 作為一種實施方式，對每條牙解的MSTN基因進行PCR擴增后，對PCR產物使用 S化Pshot SNP分型方法對牙解的MSTN基因進行鑒定，S化Pshot SNP分型方法中所用的延伸 引物的序列如下:所述SNPl位點對應的第一延伸引物的序列如SEQ ID N0:6所示;所述SNP2 位點對應的第二延伸引物的序列如SEQ ID N0:7所示;所述SNP3位點對應的第S延伸引物 的序列如SEQ ID NO: 8所示;針對每個SNP位點的延伸體系及反應相同，延伸反應體系為:總 體積為化L，PCR產物化L，Snapshot Mix試劑化L，延伸引物0.化L，余量為水;延伸程序為:在 96 °C溫度下變性Imin,然后進行30個循環，其中每個循環依次包括W下步驟:96°C溫度下變 性10s，在52°C溫度下復性5s，在60°C溫度下延伸30s;延伸程序結束后，使用測序儀對延伸 產物進行測序。
[00巧]S化Pshot SNP分型是一種W單堿基延伸原理為基礎，同時利用多重PCR對多個已 知SNP位點進行遺傳分型的方法。在一個含有測序酶，四種巧光標記的ddNTP，緊挨多態位點 5'端的不同長度延伸引物和PCR產物模板的反應體系中，引物延伸一個堿基即終止，經測序 儀跑膠后，根據峰的顏色可知滲入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型，根據峰移動的膠 位置確定該延伸產物對應的SNP位點。
[00%]其中，SEQ ID
[0027]沈Q ID 備:7的序列為(：1'押(：口'64(：1'〔6(：1'176660：;
[002引 SEQ ID
[00巧]進一步的，所述基因分型步驟中，PCR擴增反應體系為：總體積為15化，DNA化L、 10*buffer 1.5化、1.5化、dNTP 0.3ul、引物0.3ul/條、Taq酶0.3ul、余量為水;使用的PCR擴 增程序為：在94°C溫度下預變性3min;然后進行35個循環，其中每個循環依次包括W下步 驟:在94°C溫度下變性15s，在56 °C溫度下復性15s，在72°C溫度下延伸30s;完成35個循環之 后，在72°C的溫度下延伸3min。
[0030] 所述基因分型步驟中，SNPl位點、SNP2位點和SNP2位3位點分別對應第S引物組， 第四引物組和第五引物組，所述第=引物組包括第=上游引物和第=下游引物，所述第四 引物組包括第四上游引物和第四下游引物，所述第五引物組包括第五上游引物和第五下游 引物：第S上游引物的序列如SEQ ID N0:9所示，第S下游引物的序列如SEQ ID NO: 10所 示，第四上游引物的序列如SEQ ID N0:11所示，第四下游引物的序列如SEQ ID N0:12所示， 第五上游引物的序列如SEQ ID NO: 13所示，第五下游引物的序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0031] 其中，SEQ ID ^:9的序列為口'61667^40：4401；1'〔八6;
[0032] 沈Q ID 備：10的序列為(：1'1'口'6〔44616〔41614(：1'。
[0033] 沈Q ID ^:11的序列為押61667^40：4401；1'〔八6;
[0034] 沈Q ID 備：12的序列為(：1'1'口'6〔44616〔41614(：1'。
[0035] 沈Q ID N0:13的序列為ATGCACACATGCTGGACGTTG;
[0036] 沈Q ID ^:14的序列為4601746〔6444〔6161417八6。
[0037] 進一步的，所述基因分型步驟中，PCR循環結束后，進行純化步驟，再將純化后的 PCR產物進行挪aPshot SNP分型方法處理；用ExoI去除PCR產物中的剩余引物，用化StAP去 除PCR產物中剩余的dNTP。所述純化步驟為:取3ul PCR產物用ExoI和化StAP純化，