核酸的檢測方法以及試劑盒、裝置的制造方法
【專利說明】核酸的檢測方法從及試劑盒、裝置
[0001] 本申請是申請日為2010年3月15日、申請號為201080012366.0的中國發明申請"核 酸的檢測方法W及試劑盒、裝置"的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明設及能夠對通過核酸擴增方法擴增的核酸進行檢測的核酸檢測方法和試 劑盒、裝置。
【背景技術】
[0003] 在分子生物學研究領域、基因檢查等臨床應用領域中，特異性擴增祀標核酸片段 的方法成為非常重要的技術。在運樣的基因擴增方法中，除了最通用的PCR法(Polymerase Chain Reaction) W外，還開發出了無需PCR法中不可缺少的復雜溫度控制的LAMP化oop-Mediated Isothermal Amplification)法、ICANQsothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法等的等溫擴增方法。
[0004] 作為通過PCR法、LAMP法、ICAN法等擴增出的特定核酸區域的檢測方法，大致可W 分為對作為擴增產物的DNA進行檢測的方法、和對作為副產物的焦憐酸(二憐酸)進行檢測 的方法運兩類。
[0005] 檢測雙鏈核酸的最一般方法已知有對擴增反應后的溶液實施瓊脂糖電泳，使之結 合化Mdium Bromide、SYBR Green等巧光性嵌入劑，并觀察特異性的巧光的方法(非專利文 獻1)。但是，電泳后用化hidium Bromide等巧光性嵌入劑進行染色的方法需要30分~1小時 左右的泳動時間，而且需要用于檢測巧光的紫外線照射裝置、巧光檢測器等昂貴的機械。
[0006] 此外，作為無需進行電泳、而對PCR產物進行檢測和定量的方法，已知有通過預先 在PCR開始前的反應液中添加巧光性嵌入劑，并使用巧光分光光度計測定巧光強度，來測定 擴增DNA量的方法(專利文獻1)。但是，巧光性嵌入劑與引物等單鏈核酸結合，因而導致不依 賴于雙鏈核酸量的背景信號增強、檢測靈敏度降低的問題。與此相對，已知有通過用優先與 結合了單鏈核酸的嵌入劑反應的化合物進行處理，來降低背景信號的方法(專利文獻2)。但 是，在采用運些方法的情況下，需要用于檢測巧光的裝置、設備。
[0007] 作為上述W外的方法，例如已知有使用巧光標記的引物進行核酸擴增反應、并通 過巧光偏光來檢測該核酸擴增產物的方法(專利文獻3)。但是，運需要對未進入擴增產物的 巧光標記引物的分離操作，不僅煩雜，而且由于引物的分離操作，存在所得核酸擴增片段的 收獲量減少、結果導致檢測靈敏度降低的隱患。此外，一般而言，標記核巧酸、標記引物非常 昂貴，在成本方面也存在問題。
[000引此外，還已知使偏振光通過核酸擴增反應中的反應液，并通過測定該偏振光的旋 光度或圓偏光二色性來檢測核酸擴增產物的方法(專利文獻4)。但是，旋光度、圓偏光二色 性的測定需要特殊裝置。
[0009]現有技術文獻 [0010] 專利文獻
[0011] 專利文獻I:特開平5-237000號公報
[0012] 專利文獻2:國際公開第2002/103053號
[0013] 專利文獻3:特開平9-187275號公報
[0014] 專利文獻4:特開2002-186481號公報
[0015] 非專利文獻
[0016] 非專利文獻 1 =Molecular Cloning second edition, vol. 1,6.15(1989)
【發明內容】
[0017]發明所要解決的問題
[0018] 本發明的課題是提供:無需特殊裝置、簡便且高精度地目測檢測采用核酸擴增方 法擴增的核酸的核酸檢測方法、和核酸檢測裝置或試劑盒。
[0019] 解決問題的方法
[0020] 本發明人為解決上述問題進行了深入研究，結果發現:通過在核酸擴增反應的前 或后添加因與核酸結合而色調發生變化的染料，通過在可見光下進行觀察，能夠檢測核酸 擴增的有無。而且獨立發現:通過添加與結合雙鏈核酸的染料相比、優先和與單鏈核酸結合 了的染料、未與核酸結合的染料反應的化合物，改變或者消除來源于除了與雙鏈核酸結合 了的染料W外的色調，能夠簡便且高精度地目測檢測上述核酸擴增片段。而且，還制作了利 用本方法的目測核酸檢測試劑盒、裝置，從而完成了本發明。
[0021] 目P，本發明設及包含在被檢物中的核酸的檢測方法，其包括：
[0022] (1)使被檢物與染料接觸并反應的步驟；
[0023] (2)在可見光下觀察該反應生成的物質，目測判定核酸的存在的步驟。
[0024] 優選在所述步驟(1)的前或后包括使與染料反應的物質與被檢物接觸的步驟(3)。
[0025] 所述染料優選是色調通過氧化劑、還原劑、酸、堿或抑緩沖劑的處理而發生變化的 染料。
[0026] 此外，本發明設及包含在被檢物中的核酸的檢測裝置或試劑盒，其包含：
[0027] (a)保持了能夠與核酸結合的染料的載體；
[00%] (C)被檢物通過載體(a)的路徑;和
[0029] (d)在可見光下觀察由被檢物與染料的反應而生成的物質、并目測判定核酸的存 在的判定部位。
[0030] 優選在所述載體(a)與判定部位(d)之間具有(b)保持與染料反應的物質的載體。
[0031] 所述染料優選是色調通過氧化劑、還原劑、酸、堿、或pH緩沖劑的處理而發生變化 的染料。
[0032] 所述染料優選是選自=苯基甲燒類染料、嚷嗦類染料、6激嗦類染料、叮嗦類染料、 夾氧雜蔥類染料、和菲晚輸鹽類染料中的1種W上的染料。
[0033] 此外，所述染料優選是選自結晶紫、龍膽紫B、維多利亞藍B、甲基紫、夜光藍、甲基 綠、甲苯胺藍0、天青B、亞甲基藍、亮甲酪藍、甲基澄、派洛寧Y、漠化乙錠和中性紅中的巧中W 上的染料。
[0034] 所述與染料反應的物質優選是選自氧化劑、還原劑、酸、堿、或抑緩沖劑中的巧中W 上的化合物。
[0035] 所述酸優選是選自鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、甲酸、草酸、巧樣酸和乳酸中的1種W上 的酸。
[0036] 所述堿優選是選自氨氧化鋼、氨氧化鐘、碳酸氨鋼、碳酸鐘、氨和=乙基胺中的1種 W上的堿。
[0037] 所述氧化劑優選是選自過氧化氨、高儘酸鐘、氯酸鐘、重銘酸鐘、漠酸鋼、漠酸鐘、 面素、濃硫酸、硝酸、次氯酸鋼、二氧化氯、氯胺、四氧化餓、二甲基亞諷和間氯過苯甲酸中的 1種W上的氧化劑。
[0038] 所述還原劑優選是選自棚氨化鋼、氯化棚氨化鋼、亞硫酸氨鋼、亞硫酸鋼、次硫酸 鋼、焦亞硫酸鐘、硫代硫酸鋼、谷脫甘膚、抗壞血酸、2-琉基乙醇、Dk二硫蘇糖醇、1-硫代甘 油、半脫氨酸、=下基麟、氨基乙硫醇和=2-簇基乙基麟中的1種W上的還原劑。
[0039] 所述抑緩沖劑優選是選自戈氏緩沖液(Good's Buffers)、甘氨酸、憐酸、鄰苯二甲 酸、巧樣酸、己比妥酸、班巧酸、乙酸、和碳酸中的1種W上的pH緩沖劑。
[0040] 此外，本發明設及核酸的檢測裝置或試劑盒，其包含：
[0041] (e)保持能夠與核酸結合的染料、并具備能夠因外力而形成開口從而釋放出染料 的開口部的載體；
[0042] (f)將釋放出的染料引導向判定部位的路徑;和
[0043] (d)保持導入的被檢物、在可見光下觀察因從載體(e)經由路徑(f)導入的染料與 保持的被檢物之間的反應而生成的物質、并目測判定核酸的存在的判定部位。
[0044] 優選存在于所述判定部位的被檢物還包含與染料反應的物質。
[0045] 所述染料優選是色調通過氧化劑、還原劑、酸、堿、或pH緩沖劑的處理而發生變化 的染料。
[0046] 發明效果
[0047] 根據本發明的方法，無需使用特殊的檢測儀器，即可在核酸擴增后通過染料的色 調變化目測檢測核酸擴增的有無。而且，通過氧化劑、還原劑、酸、堿、pH緩沖劑引起的染料 的色調變化，能夠目測檢測核酸擴增的有無。此外，由于能夠用可見光進行檢測，能夠提供 使用可見區域分光光度計(其是一種通用性高的裝置)等的簡便的核酸檢測方法。
【附圖說明】
[0048] [圖1]顯示本發明的色譜型核酸檢測裝置的一個例子的示意圖。
[0049] [圖2]顯示本發明的濾器型核酸檢測裝置的一個例子的示意圖。
[0050] [圖3]顯示本發明的吸引型核酸檢測裝置的一個例子的示意圖。
[0051] [圖4]顯示本發明的流路型核酸檢測裝置的一個例子的示意圖。
[0052] [圖引顯示本發明的管型核酸檢測裝置的一個例子的示意圖。
[0053] [圖6 ]在實施例5中，向LAMP反應液中添加了甲基綠時的吸收光譜圖。
[0054] [圖7]在實施例5中，向LAMP反應液中添加甲基綠后、再添加了KOH時的吸收光譜 圖。
[0055] [圖引在實施例6中，向LAMP反應液中添加了甲苯胺藍加寸的吸收光譜圖。
[0056] [圖9]在實施例6中，向LAMP反應液中添加甲苯胺藍0后，再添加了亞硫酸鋼時的吸 收光譜圖。
[0057] 發明的【具體實施方式】
[0058] W下對本發明進行具體說明。
[0化9] 1.核酸的檢測方法
[0060] 本發明的包含在被檢物中的核酸的檢測方法包括：
[0061] (1)使被檢物與染料接觸并反應的步驟、
[0062] (2)在可見光下觀察該反應生成的物質，目測判定核酸的存在的步驟。
[0063] 在使被檢物與染料接觸并反應的步驟(1)中，只要被檢物與染料接觸、兩者之間發 生反應即可，可W W任何形式接觸。
[0064] 在本發明中，檢測對象是核酸，雙鏈核酸包括雙鏈DNA、雙鏈RNA、DNA與RNA的雜合 鏈、W及PNA等人工核酸的雙鏈。而且，即使是單鏈核酸，當其多個混合存在、且能被染料染 色時，也能夠采用本發明的檢測方法進行確認。
[0065] 對被檢物沒有特殊限制，只要包含核酸即可。不但可W是核酸擴增方法的反應液， 也可W是來自微生物、動物細胞或植物細胞的抽提液，還可W是來自食品的抽提液。
[0066] 核酸擴增方法只要是WPCR法為代表的擴增核酸序列的方法即可，可W是任何核 酸擴增方法。例如，除了 PCR法W外，可W示例出LCR(Ligase畑ain React ion)法、SDA (Strand Displacement Amplification)法、RCA(Rolling Circle Amplification)法、CPT (Cycling Probe Technology)法、Q-Beta Replicase Amplification Technology法、ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids)法、 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of DNA)法、NASBA(Nucleic acid Sequence-based