雙靶向gpc3和asgpr1的轉基因免疫效應細胞及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及腫瘤免疫治療領域，更具體地，本發明涉及雙祀向GPC3和ASGPRl的轉 基因免疫效應細胞及其應用。
【背景技術】
[0002] T淋己細胞在腫瘤免疫應答中的作用日益受到重視。基于T淋己細胞的過繼性免 疫治療在部分腫瘤中取得了一定的效果，并且該種免疫治療方法可W克服抗體治療的上述 缺陷，但在大多數腫瘤的療效仍不能令人滿意。近年來，根據CTL對祀細胞的識別特異性 依賴于T淋己細胞受體（T Cell Rec巧tor, TCR)的發現，將針對腫瘤細胞相關抗原的抗體 的SCFv與T淋己細胞受體的CD3弓或化e RI Y等胞內信號激活基序融合成嵌合抗原受體 煙iimeric antigen rec巧tor, CAR),并將其通過如慢病毒感染等方式基因修飾在T淋己細 胞表面。送種CAR T淋己細胞能夠W主要組織相容性復合物（Major Histocompatibility Complex，MHC)非限制性方式選擇性地將T淋己細胞定向到腫瘤細胞并特異性地殺傷腫瘤。 CAR T淋己細胞是腫瘤免疫治療領域的一個新的免疫治療策略。
[0003] 嵌合抗原受體（CAR)包括胞外結合區，跨膜區和胞內信號區。通常胞外區包含能 夠識別腫瘤相關抗原的scFv，跨膜區采用CD8，CD28等分子的跨膜區，胞內信號區采用免疫 受體酪氨酸活化基序（ITAM) CD3弓或Fc e RI Y及共刺激信號分子CD28、CD137、CD134等的 胞內信號區。
[0004] 胞內信號區僅包含ITAM的為第一代CAR T淋己細胞，其中嵌合抗原受體 各部分按如下形式連接；scFv-TM-ITAM。該種CAR T可W激發抗腫瘤的細胞毒性效 應，但是細胞因子分泌比較少，并且在體內不能激發持久的抗腫瘤效應[Zhang T.et al.Chimeric NKG2D_modi円ed T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in amanner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways, Can Res 2007， 67(22):11029 - 11036. ]O
[0005] 隨后發展的第二代CAR T淋己細胞加入了 CD28或CD137 (又名4-lBB)的 胞內信號區，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連接；SCFV-TM-CD28-ITAM或 scFv-TM-CD137-ITAM。胞內信號區發生的B7/CD28或4-1BMVCD137共刺激作用引起T淋 己細胞的持續增殖，并能夠提高T淋己細胞分泌IL-2和IFN-Y等細胞因子的水平，同時提 高CAR T在體內的存活周期和抗腫瘤效果[Dotti G.et al.CD28costimulation improves exp曰nsion 曰nd persistence of chimeric 曰ntigen receptor modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest,2011，121巧）：1822-1826. ] O
[0006] 近些年發展的第H代CAR T淋己細胞，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連 接；scFv-TM-CD28-CD137-ITAM 或 scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，進一步提高了 CAR T 在體 內的存活周期和其抗腫瘤效果[Ca巧enito C.，et al. Control of large est油Iished tumor xenografts with genetic曰Ily ret曰rgeted hum曰n T cells cont曰ining CD28曰nd CD137domains. PNAS，2009,106 巧）：3360 - 3365.]。
[0007] 盡管CAR T淋己細胞在腫瘤免疫治療中具有誘人的前景，但一些潛在的風險亦需 要考慮。比如，由于某些/種正常組織低表達CAR所能識別的特異性抗原可能造成CAR T 淋己細胞對表達相應抗原的正常組織的損傷。如，針對腎細胞癌患者腫瘤細胞上表達的抗 原碳酸酢酶IX(CAI訝是第一個用于臨床的CAR T淋己細胞過繼治療的案例，也是第一個 報道含CAR細胞的脫祀效應的案例。病人在多次輸入CAR T淋己細胞后出現2-4級肝毒 性。分析原因為肝膽管上皮細胞低表達CAIX，原臨床試驗被迫中斷同時排除了病人治療效 果的任何評價[Stoter G. et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with 曰utologous T-Iymphocytes genetic曰Ily ret曰rgeted 曰g曰inst c曰rbonic 曰nhydr曰se IX: first clinical experience. J din oncol, 2006,24 (13) : e20-e22. ；Ngo MG.，et 曰I. Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of c曰ncer. Hum曰n Molecular Genetics, 2011，Rl-R7]。另外，CAR中過多的共刺激信號會降低效應細胞激 活所需的闊值，使得基因修飾的T淋己細胞在低水平抗原或沒有抗原觸發的條件下也可 能會被活化，導致大量細胞因子的釋放W致可能引發所謂的"細胞因子風暴"。送種信號 外漏（Singnal leakage)會導致脫祀細胞毒性，從而產生非特異性的組織損傷。例如，在 采用針對化r2的第H代CAR臨床治療一個具有肝和肺轉移的晚期結腸癌患者的過程中 由于正常肺組織中低表達化r2而引發所謂的"細胞因子風暴"致病人粹死[Morgan RA.， et al. Report of a serious adverse event following the administration of T cells tr曰nsduced with 曰 chimeric 曰ntigen receptor recognizing Erbb2. Moleculsr 化erapy，2010,18(4) :843 - 851.]。因此，本領域迫切需要研究化解CAR T細胞療效低及存 在潛在風險的問題的方法，開發出更有效殺傷腫瘤細胞的方法。
[0008] 磯脂醜肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3, GPC3,又稱 DGSX，GTR2-2, MXR7, 0CI-5， 50￥5,568,5685或56851)是一種細胞表面蛋白，屬于硫酸己醜肝素蛋白多糖家族。6口〔3基 因編碼產生70-kDa左右的前體核必蛋白，該前體蛋白能夠被弗林蛋白酶（化rin)剪切產生 40-kDa左右的可溶性的能夠進入血液的氨基端（N末端）膚和30-kDa左右含有2個硫酸 己醜肝素化巧糖鏈的膜結合的駿基端（C末端）膚。GPC3蛋白通過糖基磯脂醜肌醇（GPI) 鋪依附在細胞膜上。
[0009] GPC3高度表達于胎兒肝臟，而不表達于正常成年人的肝組織，但在肝細胞肝癌中 恢復表達，與肝癌的發生發展有十分密切的關系，不僅在肝癌發生的早期檢出率較高，而且 隨著肝癌的發展，其檢出率也隨之增高。而GPC3的表達在肝腺癌，膽管細胞癌，肝轉移癌和 12種常見實體瘤和21種非肝癌細胞系中均未檢測出。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢 透明細胞癌、卵黃囊瘤、神經母細胞瘤等腫瘤中表達。
[0010] 利用抗GPC3抗體進行肝癌檢測和利用抗GPC3抗體的抗體依賴的（ADCC)或補體 依賴的（CDC)細胞毒性研究方案已有報道。一般用于治療的抗體識別的是GPC3蛋白的C 末端。然而，抗體治療存在著抗體在體內血液循環中半衰期的限制，一般來說，半衰期大多 在23天W內。因此，持續給藥和/或增大給藥劑量是腫瘤抗體治療所要求的，送導致患者 治療成本的增加，W及某些情況下，甚至不得已終結治療。另外，治療性抗體作為異源蛋白， 還有可能在體內產生過敏反應及針對該治療性抗體的中和性抗抗體的風險。
[0011] 本發明人的已有研究表明針對GPC3的CAR T細胞對GPC3陽性的肝癌細胞具有非 常好的殺傷作用（CN201310164725.X)。但是，GPC3雖然在肝臟等大部分正常器官沒有表 達，但是在胃腺體（3/7[43% ])、腎小管（巧/17[53% ])和睪丸生殖細胞中有表達。需要 考慮單獨祀向GPC3的CAR T細胞就有可能對送些正常組織（胃腺體，腎小管和睪丸生殖細 胞）產生損傷。
[0012] 去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor, ASGPRl，或稱 ASGR1)，又 稱半乳糖受體，是一種跨膜蛋白，相對分子質量約41000,由Hl和肥兩個結構不同的亞 基組成，化是受體的主要組分。ASGPRl的胞外結構域含有糖識別結構域（carbohy化ate recognition domain, C畑），能識別和結合半乳糖殘基和N己醜半乳糖胺殘基。當C畑與特 異的糖殘基結合后，即發生受體介導的胞吞作用。ASGPRl的主要功能是清除外周血循環中 失去末端唾液酸而暴露半乳糖殘基或己醜半乳糖胺殘基的糖蛋白、脂蛋白和調亡細胞，還 介導嗜肝病毒（如己肝病毒和丙肝病毒）與肝細胞的結合及攝取。ASGPRl主要表達于哺乳 動物肝竇狀隙的肝實質細胞表面，密度很高，每個細胞表面可多達500000個受體。在發生 肝細胞肝癌、肝炎、肝硬化等肝臟疾病時，ASGPRl表達數量及功能有所下降。
[0013] 目前現有技術中，從來沒有關于ASGPRl作為免疫細胞治療的祀點，更沒有將 GPC3、ASGPRl與CAR免疫效應細胞聯合應用的報導。
【發明內容】
[0014] 本發明的目的在于提供一種雙祀向GPC3和ASGPRl的轉基因免疫效應細胞及其應 用。
[0015] 在本發明的第一方面，提供一種雙祀向的嵌合抗原受體（CAR)免疫效應細胞，該 細胞表達如下嵌合受體；特異性識別GPC3的嵌合抗原受體；和特異性識別ASGPRl的嵌合 抗原受體。
[0016] 在一個優選例中，所述的特異性識別GPC3的嵌合抗原受體包括：抗GPC3的單鏈抗 體（SCfv)，T細胞刺激信號分子。
[0017] 在另一優選例中，所述的T細胞刺激信號分子選自；CD3^或FceRIy ;更佳地， 所述的特異性識別GPC3的嵌合抗原受體包括（較佳地5' - 3');抗GPC3的單鏈抗體 (SCfv) ,CDS 跨膜區，CD3 與。
[001引在另一優選例中，在抗GPC3的單鏈抗體（SCfv)的5'端，還包括報告基因1(如 eGFP)、F2A，藉由F2A將報告基因1與抗GPC3的單鏈抗體相連，藉由報告基因1呈現細胞內 所述特異性識別GPC3的嵌合抗原受體的表達情況。
[0019] 在另一優選例中，所述的特異性識別GPC3的嵌合抗原受體具有SEQ ID NO: 17所 示的氨基酸序列。
[0020] 在另一優選例中，所述的特異性識別GPC3的嵌合抗原受體由病毒載體表達；較佳 地為慢病毒載體，如pWPT。
[0021] 在另一優選例中，所述的特異性識別ASGPRl的嵌合抗原受體包括：抗ASGPRl的單 鏈抗體（SCfv)，T細胞激活的共刺激信號分子。
[0022] 在另一優選例中，所述的T細胞激活的共刺激信號分子選自；CD27, CD28, CD137， CD134, ICOS蛋白的胞內信號區，或其組合；更佳地，所述的特異性識別ASGPRl的嵌合抗原 受體包括（較佳地5' - 3');抗ASGPRl的單鏈抗體（SCfv)，CD28分子的跨膜區仰28a)， CD28分子的胞內信號區（CD28b)和CD137胞內信號區。
[002引在另一優選例中，在抗ASGPRl的單鏈抗體（scfv)的5'端，還包括報告基因2(如 mCher巧）、F2A，藉由F2A將報告基因2與抗ASGPRl的單鏈抗體相連，藉由報告基因2呈現 細胞內所述特異性識別ASGPRl的嵌合