一種免疫細胞體外擴增培養的無血清培養基及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于細胞生物學、分子生物學和醫學領域的研究領域，涉及一種免疫細胞體外擴增培養的無血清培養基，更具體地說，涉及用于免疫細胞體外擴增培養的無血清培養基及其應用。
【背景技術】
[0002]細胞免疫治療技術是一種療效顯著的全新的抗腫瘤治療的方法。通過采集人體免疫細胞，經過體外富集、活化，并擴增，使其靶向性殺傷力增強，再輸回到人體，達到治療多種免疫疾病的目的。然而體外培養擴增，需要適合免疫細胞生長擴增的培養基，包括適宜的滲透壓，為細胞提供生長所必需的營養物質，同時也要保護細胞免受代謝過程中產生的毒性物質的損害。
[0003]傳統的細胞培養主要是在基礎培養基中添加一定濃度的人或動物血清。但由于血清成分復雜，雖含有許多對細胞有利成分，也含有對細胞有害的成分，并且本身有攜帶細菌、病毒、蛋白傳染性疾病的風險。人血清昂貴，不適宜大規模擴增。由于血清供體的不同，導致批次間存在很大差異。因此，血清在細胞臨床大規模培養中有很多不利因素。
[0004]目前很多人研究無血清培養基，一些公司也已經開發了無血清培養基產品，比如LONZA公司開發的X-VIVO系列的無血清培養基等等，這些無血清培養基成分不明確，而且價格昂貴，大大增加了免疫細胞治療的成本，不利于廣泛推廣。中國專利申請201110081988公開了一種人源性無血清培養基及其制備方法，其配方包括用治療用人血清白蛋白溶液、人重組胰島素溶液、人轉鐵蛋白溶液、人膽固醇溶液、人過氧化氫酶溶液、2-巰基乙醇溶液、抗壞血酸溶液、亞油酸溶液、乙醇胺溶液、人玻連蛋白溶液和L-谷胺酰胺溶液11種原料。添加人血白蛋白、人轉鐵蛋白等人源性組分的無血清培養基雖然對原料血漿進行了相關病原體的篩查，并在生產工藝中加入了去除和滅活細菌的措施，但在理論上仍存在傳播某些已知和未知病原體的潛在風險。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是提供一種用于培養細胞的無血清培養基。
[0006]本發明的用于培養細胞的無血清培養基包括重組人血白蛋白、重組人胰島素、重組人轉鐵蛋白、巰基乙醇、乙醇胺、膽固醇、亞油酸、油酸、硫酸銅、硫酸鋅、檸檬酸鐵和碳酸氫鈉。
[0007]上述無血清培養基中，所述重組人血白蛋白、所述重組人胰島素和所述重組人轉鐵蛋白均指能通過基因工程手段進行體外表達得到的，是能夠重復人工制備的。避免了動物源性和人源性所帶來的潛在風險。
[0008]上述無血清培養基中，
[0009]所述重組人血白蛋白、所述重組人胰島素、所述重組人轉鐵蛋白、所述β-巰基乙醇、所述乙醇胺、所述膽固醇、所述亞油酸、所述油酸、所述硫酸銅、所述硫酸鋅、所述檸檬酸鐵和所述碳酸氫鈉的質量比為0.1-lOg: l-50mg:5-200mg: 1-1Omg: l_50mg: l_100mg:0.1-5mg:0.1-5mg:0.0001-0.01mg:0.l_5mg:0.l_10mg:3.024g。
[00?0] 上述無血清培養基中，
[0011]所述重組人血白蛋白、所述重組人胰島素、所述重組人轉鐵蛋白、所述β-巰基乙醇、所述乙醇胺、所述膽固醇、所述亞油酸、所述油酸、所述硫酸銅、所述硫酸鋅、所述檸檬酸鐵和所述碳酸氫鈉的質量比為4g: 15mg: 70mg: 4mg: 5mg: 1mg: 0.4mg: 0.4mg: 0.0Olmg:
0.8mg:0.8mg:3.024g。
[0012]上述無血清培養基中，
[0013]所述培養基還包括基礎培養基、重組人γ-干擾素和重組人白細胞介素-2;
[0014]所述基礎培養基為細胞基礎培養基;所述細胞基礎培養基具體為IMDM基礎培養基;
[0015]所述培養基由所述頂DM基礎培養基、所述重組人血白蛋白、所述重組人胰島素、所述重組人轉鐵蛋白、所述巰基乙醇、所述乙醇胺、所述膽固醇、所述亞油酸、所述油酸、所述硫酸銅、所述硫酸鋅、所述檸檬酸鐵、所述碳酸氫鈉、所述重組人γ -干擾素和所述重組人白細胞介素-2組成。其中，所述重組人γ -干擾素和所述重組人白細胞介素-2是均在細胞培養的過程中加入。
[0016]上述無血清培養基中，所述培養基的pH為6.8-7.2。
[0017]上述無血清培養基中，
[0018]所述重組人血白蛋白在所述無血清培養基中的濃度為0.l-10g/L;
[0019]所述重組人胰島素在所述無血清培養基中的濃度為l-50mg/L;
[0020]所述重組人轉鐵蛋白在所述無血清培養基中的濃度為5_200mg/L;
[0021 ]所述β-巰基乙醇在所述無血清培養基中的濃度為l-10mg/L;
[0022]所述乙醇胺在所述無血清培養基中的濃度為l-50mg/L;
[0023]所述膽固醇在所述無血清培養基中的濃度為l-100mg/L;
[0024]所述亞油酸在所述無血清培養基中的濃度為0.l-5mg/L;
[0025]所述油酸在所述無血清培養基中的濃度為0.l_5mg/L;
[0026]所述硫酸銅在所述無血清培養基中的濃度為0.0001-0.0 lmg/L;
[0027]所述硫酸鋅在所述無血清培養基中的濃度為0.l_5mg/L;
[0028]所述檸檬酸鐵在所述無血清培養基中的濃度為0.l-10mg/L;
[0029]所述碳酸氫鈉在所述無血清培養基中的濃度為2.5-3.5g/L
[0030]所述重組人γ-干擾素在所述無血清培養基中的濃度為100-1000IU/mL;
[0031 ]所述重組人白細胞介素-2在所述無血清培養基中的濃度為100-500IU/mL。
[0032]上述無血清培養基中，
[0033 ]所述重組人血白蛋白在所述無血清培養基中的濃度為4g/L;
[0034]所述重組人胰島素在所述無血清培養基中的濃度為15mg/L;
[0035]所述重組人轉鐵蛋白在所述無血清培養基中的濃度為70mg/L;
[0036]所述β-巰基乙醇在所述無血清培養基中的濃度為4mg/L;
[0037]所述乙醇胺在所述無血清培養基中的濃度為5mg/L;
[0038]所述膽固醇在所述無血清培養基中的濃度為10mg/L;
[0039]所述亞油酸在所述無血清培養基中的濃度為0.4mg/L;
[0040]所述油酸在所述無血清培養基中的濃度為0.4mg/L；
[0041 ]所述硫酸銅在所述無血清培養基中的濃度為0.001mg/L;
[0042]所述硫酸鋅在所述無血清培養基中的濃度為0.8mg/L；
[0043]所述檸檬酸鐵在所述無血清培養基中的濃度為0.8mg/L;
[0044]所述碳酸氫鈉在所述無血清培養基中的濃度為3.024g/L;
[0045]所述重組人γ-干擾素在所述無血清培養基中的濃度為600IU/mL;
[0046]所述重組人白細胞介素-2在所述無血清培養基中的濃度為300IU/mL。
[0047]本發明的無血清培養基在具體的使用中，先將一袋一升裝IMDM干粉(Gibco12200036)、重組人血白蛋白(Invitria公司，Cellastim)、重組人胰島素(大腸桿菌重組表達，LIFE公司)、重組人轉鐵蛋白(酵母重組表達，Invitria公司)、β-巰基乙醇(Invitrogen，21985-023)、乙醇胺(Sigma,Ε0135)、膽固醇(Sigma ,C1231)、亞油酸(Sigma,L1012)、油酸(Sigma, 01383)、硫酸銅(Sigma, C8027)、硫酸鋅(Sigma, Z0251)、檸檬酸鐵(Sigma, F3388)、碳酸氫鈉(Sigma，S5761)和水混勻，得到免疫細胞無血清培養體系;再將待培養的免疫細胞加入上述免疫細胞無血清培養體系中，并在細胞培養的過程中，加入重組人γ -干擾素(山東泉港藥業)和重組人白細胞介素_2(北京雙鷺藥業)。
[0048]本發明的另一個目的是提供上述培養基的新用途。
[0049]本發明提供了上述培養基在細胞體外擴增培養中的應用。
[0050]本發明還提供了上述培養基在提高細胞存活率和/或菌落數和/或殺瘤率中的應用。
[0051 ]本發明的最后一個目的是提供一種細胞的培養方法。
[0052]本發明提供的細胞的培養方法包括如下步驟:用上述培養基培養細胞。
[0053]上述培養基或上述應用或上述方法中，所述細胞為免疫細胞;所述免疫細胞具體為離體外周血單核細胞。
[0054]通過實驗證明:用本發明的免疫細胞無血清培養基培養的免疫細胞性狀更穩定，細胞生長及增殖效果更好。且本發明的免疫細胞無血清培養基化學成分明確、具有批間差異小、質量穩定、可以保證培養基批次間的一致性，無動物源性和無人源性，安全性高，克服了添加人或動物血清帶來的潛在風險，有助于研究各種免疫細胞的作用機制，推動國內細胞治療的安全性的標準化，減少患者意外感染的風險，對免疫治療的推廣應用具有重要意義。
【具體實施方式】
[0055]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0056]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0057]實施例1、免疫細胞無血清培養基的配制
[0058]將一袋一升裝IMDM干粉(Gibco 12200036 )、重組人血白蛋白(Invitria公司，Cellastim)、重組人胰島素(大腸桿菌重組表達，LIFE公司)、重組人轉鐵蛋白(酵母重組表達，Invitria公司)、β-巰基乙醇(Invitrogen，21985-023)、乙醇胺(Sigma,E0135)、膽固醇(Sigma, C1231)、亞油酸(Sigma, L1012)、油酸(Sigma, 01383)、硫酸銅(Sigma, C8027)、硫酸鋅(Sigma，Z0251)、檸檬酸鐵(Sigma，F3388)、碳酸氫鈉(Sigma，S5761)和超純水混勻，得到免疫細胞無血清培養體系。攪拌溶解，調節PH值至7.0，并用0.22μπι濾膜過濾除菌。4 °C保存。
[0059]在細胞培養的過程中再向上述免疫細胞無血清培養體系中加入重組人γ-干擾素(山東泉港藥業)和重組人白細胞介素-2 (北京雙鷺藥業)，得到免疫細胞無血清培養基。
[0060]其中，各個溶質組分及其在免疫細胞無血清培養基中的濃度分別為:重組人血白蛋白4g/L；重組人胰島素15mg/L；重組人轉鐵蛋白70mg/L；β_巰基乙醇4mg/L ；乙醇胺5mg/L ；膽固醇10mg/L ；亞油酸0.4mg/L；油酸0.4mg/L ；硫酸銅0.00 lmg/L ；硫酸鋅0.8mg/L ；朽1檬酸鐵0.8mg/L ；碳酸氫鈉3.024g/L ；重組人γ _干擾素(INF-r)600IU/mL ；重組人白細胞介素_2(IL-2)300IU/mLo
[0061 ]實施例2、免疫細胞無血清培養基在培養免疫細胞中的應用