一種硫酸軟骨素聚電解質納米粒的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明公開了一種高得率以及高生物利用度硫酸軟骨素聚電解質納米粒的制備方法，屬于硫酸軟骨素領域。
【背景技術】
[0002]硫酸軟骨素是從豬、牛、雞和鳘魚的軟骨中提取的一種由D-葡萄糖酸酸和N-乙醜-D-半乳糖胺組成的酸性粘多糖，常溫下為白色粉末，無臭，無味，吸水性強，易溶于水而成粘度大的溶液，遇較高溫度或酸即不穩定。它具有抗凝血和抗血栓作用，臨床用于治療冠狀動脈硬化、血脂和膽固醇增高、心絞痛、神經痛、心肌缺血和心肌梗塞等癥。
[0003]目前，國內外硫酸軟骨素的提取多來自豬軟骨、豬喉骨、雞胸軟骨；牛或羊鼻骨、喉骨、軟肋、氣管、月牙骨以及各部位的雜軟骨;魚軟骨、蛋殼膜等。硫酸軟骨素主要利用動物提取法和發酵法進行提取制備。
[0004]普通軟骨素產品存在分子量波動大、口服吸收差、生物利用度低、療效不穩定等缺點。有實驗表明，中低分子量的硫酸軟骨素產品的體內吸收均明顯優于普通分子量的產品，分子量越小吸收率越高。硫酸軟骨素的生物活性隨分子量不同而各異，其藥理活性與分子量有著密切的關系。
【發明內容】
[0005]本發明主要解決的技術問題:針對目前普通軟骨素產品存在分子量波動大、口服吸收差、生物利用度低、療效不穩定，而且提取的硫酸軟骨素收率不高、質量不穩等問題，提供了一種高得率以及高生物利用度硫酸軟骨素聚電解質納米粒的制備方法，本發明先將雞軟骨進行酶解去除表面的雜蛋白，再堿溶、醇沉得硫酸軟骨素，加入殼聚糖后硫酸軟骨素采用聚電解質復合法制備聚電解質納米粒，本發明制備得到的聚電解質納米粒生物相容性好、分子量小、口服吸收效果好、生物利用率高，而且該方法操作簡單，殼聚糖和硫酸軟骨素室溫條件下即可在水相內完成聚電解質納米粒的制備，硫酸軟骨素質量好，收率高，在制備中加入凍干保護劑，不僅可以提高電解質納米粒的溶解性和穩定性，而且可以控制其納米粒徑不易變大、從而進一步提尚穩定性。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是:
(1)稱取I?2kg雞軟骨用去離子水沖洗3?5遍，用刀切除鈣化的部分，洗凈后將雞軟骨放入陶瓷酶解罐中，按料液比1: 5向罐中加入相應體積的蒸餾水，得酶解底物，用濃度為
0.5mol/L乙酸溶液調節pH至1.5?2.5 ；
(2)當pH調至預設值時，加入酶解底物總質量0.5?0.7%的胃蛋白酶，攪拌均勻后移入恒溫箱，在30?40°C下保溫酶解7?9h，過濾分離得到酶解去除雜蛋白后的雞軟骨，放入烘箱中在105?110 °C下干燥I?2h，再經研缽研磨后過40目標準篩，得到去雜雞軟骨素；
(3)將上述得到的去雜雞軟骨素按料液比1:6和質量濃度為10%氫氧化鈉溶液進行混合，移入40?45°C水浴鍋中，保溫浸提5?6h后用臥式離心機以4000?5000r/min離心20?30min，分離去除下層沉淀得到上清液；
(4)用濃度為0.3moI/L鹽酸調節上述上清液pH至5.5?6.5，加入上清液總體積I/20的質量濃度為4%乙酸鈉溶液，用玻璃棒攪拌均勻后再加入混合液總體積2/3的無水乙醇，放入超聲振蕩儀以200?300W功率超聲振蕩反應I?2h后移入4?6°C的冰水浴中，靜置沉淀過夜，經高速離心機離心分離后干燥，得到硫酸軟骨素；
(5)稱取10?20g殼聚糖溶于500?100mL質量濃度為10%醋酸溶液中，得殼聚糖溶液，再稱取10?20g上述制得的硫酸軟骨素，溶于500?100mL蒸餾水，配制得硫酸軟骨素溶液；
(6)將上述制得的硫酸軟骨素溶液逐滴滴入以600?700r/min轉速攪拌中的殼聚糖醋酸溶液中，控制滴加速度使其15?20min內滴加完畢，繼續攪拌5?1min形成均一的混懸液；
(7)向上述混懸液中加入其體積1/10葡萄糖和海藻酸鈉混合液作為保護劑，所述混合液中葡萄糖質量占10%，海藻酸鈉質量占5%，放入高剪切分散機中分散均勻，再經真空凍干機于-40?-30°C下凍干后粉碎并過200目標準篩，即得高得率以及高生物利用度硫酸軟骨素聚電解質納米粒。
[0007]本發明的應用的方法:分別配制180?200mL的模擬人工胃液和120?150mL pH4.0的磷酸鹽緩沖液作為透析介質分別置于錐形瓶中備用，取0.3?0.Sg本發明制備的聚電解質納米粒取置于截留分子量為10000的透析袋中，分別將裝有載藥聚電解質納米粒的透析袋置于盛有人工胃液和磷酸鹽緩沖液的透析介質錐形瓶中，采用恒溫振蕩水浴法，在35?37°C溫度和130?150r/min振蕩頻率條件下，振蕩10?12h，每隔Ih取透析外液3?5mL，采用紫外分光光度法進行測量，計算累計釋放率，3.5h后達到75%以上釋放率，24h釋放率可達到95%以上。
[0008]本發明的有益效果是:
(1)本發明制備得到的聚電解質納米粒生物相容性好、分子量小、口服吸收效果好、生物利用率高；
(2)本發明操作方法簡單，殼聚糖和硫酸軟骨素在室溫條件下即可在水相內完成聚電解質納米粒的制備，發展前景廣闊，在制備中加入凍干保護劑，不僅可以提高電解質納米粒的溶解性和穩定性，而且可以控制其納米粒徑不易變大。
【具體實施方式】
[0009]稱取I?2kg雞軟骨用去離子水沖洗3?5遍，用刀切除鈣化的部分，洗凈后將雞軟骨放入陶瓷酶解罐中，按料液比1:5向罐中加入相應體積的蒸餾水，得酶解底物，用濃度為0.5mol/L乙酸溶液調節pH至1.5?2.5 ；當pH調至預設值時，加入酶解底物總質量0.5?0.7%的胃蛋白酶，攪拌均勻后移入恒溫箱，在30?40°C下保溫酶解7?9h，過濾分離得到酶解去除雜蛋白后的雞軟骨，放入烘箱中在105?110 °C下干燥I?2h，再經研缽研磨后過40目標準篩，得到去雜雞軟骨素;將上述得到的去雜雞軟骨素按料液比1:6和質量濃度為10%氫氧化鈉溶液進行混合，移入40?45°C水浴鍋中，保溫浸提5?6h后用臥式離心機以4000?5000r/min離心20?30min，分離去除下層沉淀得到上清液；用濃度為0.3mol/L鹽酸調節上述上清液pH至5.5?6.5，加入上清液總體積1/20的質量濃度為4%乙酸鈉溶液，用玻璃棒攪拌均勻后再加入混合液總體積2/3的無水乙醇，放入超聲振蕩儀以200?300W功率超聲振蕩反應I?2h后移入4?6°C的冰水浴中，靜置沉淀過夜，經高速離心機離心分離后干燥，得到硫酸軟骨素;稱取10?20g殼聚糖溶于500?100mL質量濃度為10%醋酸溶液中，得殼聚糖溶液，再稱取10?20g上述制得的硫酸軟骨素，溶于500?100mL蒸餾水，配制得硫酸軟骨素溶液;將上述制得的硫酸軟骨素溶液逐滴滴入以600?700r/min轉速攪拌中的殼聚糖醋酸溶液中，控制滴加速度使其15?20min內滴加完畢，繼續攪拌5?1min形成均一的混懸液；向上述混懸液中加入其體積1/10葡萄糖和海藻酸鈉混合液作為保護劑，所述混合液中葡萄糖質量占10%，海藻酸鈉質量占5%，放入高剪切分散機中分散均勻，再經真空凍干機于-40?-30 0C下凍干后粉碎并過200目標準篩，即得高得率以及高生物利用度硫酸軟骨素聚電解質納米粒。
[0010]實例 I
稱取Ikg雞軟骨用去離子水沖洗3遍，用刀切除鈣化的部分，洗凈后將雞軟骨放入陶瓷酶解罐中，按料液比1: 5向罐中加入相應體積的蒸餾水，得酶解底物，用濃度為0.5mo I/L乙酸溶液調節PH至1.5;當pH調至預設值時，加入酶解底物總質量0.5%的胃蛋白酶，攪拌均勻后移入恒溫箱，在30°C下保溫酶解7h，過濾分離得到酶解去除雜蛋白后的雞軟骨，放入烘箱中在105°C下干燥lh，再經研缽研磨后過40目標準篩，得到去雜雞軟骨素;將上述得到的去雜雞軟骨素按料液比1:6和質量濃度為10%氫氧化鈉溶液進行混合，移入40°C水浴鍋中，保溫浸提5h后用臥式離心機以4000r/min離心20min，分離去除下層沉淀得到上清液；用濃度為0.3mol/L鹽酸調節上述上清液pH至5.5，加入上清液總體積1/20的質量濃度為4%乙酸鈉溶液，用玻璃棒攪拌均勻后再加入混合液總體積2/3的無水乙醇，放入超聲振蕩儀以200W功率超聲振蕩反應Ih后移入4°C的冰水浴中，靜置沉淀過夜，經高速離心機離心分離后干燥，得到硫酸軟骨素;稱取1g殼聚糖溶于500mL質量濃度為10%醋酸溶液中，得殼聚糖溶液，再稱取1g上述制得的硫酸軟骨素，溶于500mL蒸餾水，配制得硫酸軟骨素溶液;將上述制得的硫酸軟骨素溶液逐滴滴入以600r/min轉速攪拌中的殼聚糖醋酸溶液中，控制滴加速度使其15min內滴加完畢，繼續攪拌5min形成均一的混懸液；向上述混懸液中加入其體積1/10葡萄糖和海藻酸鈉混合液作為保護劑，所述混合液中葡萄糖質量占10%，海藻酸鈉質量占5%，放入高剪