內皮細胞選擇性聚乙二醇類二元共聚物及復合涂層的制備和應用方法
【技術領域】
[0001] 本發明所屬技術領域為材料、生物、物理、化學等學科的交叉學科領域，涉及一種 內皮細胞選擇性聚乙二醇類二元共聚物及該共聚物的制備方法，此外，本發明還涉及該二 元共聚物在制備復合涂層中的應用及應用方法。
【背景技術】
[0002] 藥物洗脫支架的廣泛使用，為高效、微創地治療心血管疾病提供了良好的手段。然 而，藥物洗脫支架自身攜帶的藥物在治療由平滑肌細胞過度增生引起的再狹窄的同時，它 們也會降低內皮細胞的迀移與增殖能力，使血管內皮層遭到破壞，增加了晚期血栓的風險。 由藥物非選擇性抑制效應引起的內皮化延遲和晚期血栓依然是制約其應用的關鍵問題。為 了解決這一關鍵問題，人們進行了 一系列嘗試。
[0003] 血管內皮化程度與支架植入后血管再狹窄有著密切的聯系，因此基于內皮化的研 究已經成為心血管植入材料預防再狹窄的新策略。通過功能界面材料實現生物活性分子的 固定，原位增強內皮細胞的選擇性黏附和競爭性生長，實現血管內皮在植入部位的原位快 速愈合，是解決心血管植入材料生物相容性的重要途徑之一。基于細胞糖質衣仿生的單體 材料不僅可有效改善材料的血液相容性，而且可有效實現對包括蛋白質、血小板和細胞的 非特異性阻抗，已成為心血管植入材料界面修飾的有效手段之一。含反應活性功能基團的 可聚合單體可以特異性結合一些生物分子，具有良好的反應活性。
【發明內容】
[0004] 本申請是在專利號為2010102490045發明專利基礎上的進一步研究，該發明專利 的涂層材料需要通過三種單體聚合而得，而本申請僅需要通過兩種單體，即將具有生物活 性的內皮選擇性多肽分子與生物相容性單體相結合，可以構建一種新型的復合功能涂層材 料，進而得到具有內皮細胞選擇性的新型心血管支架涂層。這種新型功能涂層可以有效促 進支架的原位內皮化作用，與傳統的藥物洗脫支架相比，這種方法可以在體內迅速原位捕 獲循環血液中的內皮細胞，形成快速內皮化的過程；同時抑制平滑肌細胞的生長，避免了血 栓、再狹窄等不良反應的產生。這種聚乙二醇類復合功能涂層材料可以保持支架表面的非 特異性阻抗性能，同時實現體內原位內皮細胞捕獲能力，且得到的涂層結構穩定，能適應人 體的內環境，在心血管再狹窄、癌癥等方面具有良好的應用前景。
[0005] 本發明第一個目的是提供一種內皮細胞選擇性聚乙二醇類二元共聚物，該二元共 聚物，由細胞糖質衣仿生的生物相容性單體以及含可反應活性功能基團的可聚合單體通過 自由基聚合的方法合成；
[0006] 所述的細胞糖質衣仿生的生物相容性單體選自如下單體：
[0008] 其中 R = H 或 CH3，n=l-50;
[0009] 所述的含可反應活性功能基團的可聚合單體如下：
[0011]優選的，所述的細胞糖質衣仿生的生物相容性單體，R=H或CH3，n = 5-30。
[0012]本發明第二個目的是請求保護上述內皮細胞選擇性聚乙二醇類二元共聚物的制 備方法，包括以下步驟：
[0013] (1)將細胞糖質衣仿生的生物相容性單體和含可反應活性功能基團的可聚合單體 按照重量比10:1~1:10的比例溶解在溶劑中，溶質與溶劑質量比為1:5~1:50,獲得溶液A;
[0014] (2)按照步驟（1)中兩種單體總質量的0.2%~2%稱取自由基引發劑偶氮二異丁 腈，加入到溶液A中，得到溶液B;
[0015] (3)用氮氣或者氬氣對溶液B除氧5~30min;
[0016] (4)將除氧后的溶液加熱到50~90°C，反應6~48h;
[0017] (5)減壓除去溶劑，用冰乙醚沉析2~3次，得到具有內皮細胞選擇性聚乙二醇類二 元共聚物。
[0018] 進一步的，步驟（1)所述溶劑為四氫呋喃、氯仿、二氯甲烷、異丙醇、乙醇或甲醇中 的一種。
[0019] 本發明第三個目的是請求保護具有本發明聚乙二醇類二元共聚物的復合涂層。該 復合涂層包含內皮細胞選擇性聚乙二醇類二元共聚物及固定在基材表面的生物活性分子。
[0020] 生物活性分子種類的擴大使得選擇時可以有更寬泛的自由度，根據實際情況進行 選擇最合適的生物分子，如相容性、基材表面、體內環境或成本等因素。
[0021] 優選的，本發明生物活性分子為含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的RGD多肽，含精 氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸序列的REDV多肽，含環精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的 cR⑶環肽，含酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸的HGSR多肽，CD34抗體或CD133抗 體中的一種。
[0022] 優選的，基材為聚對苯二甲酸乙二醇酯基底膜、玻璃基底膜、不銹鋼基底膜或不銹 鋼心血管支架中的一種。
[0023] 本發明第四個目的是請求保護上述內皮細胞選擇性聚乙二醇類復合涂層在心血 管支架上的應用。
[0024]該應用的方法包括如下步驟：
[0025] (a)將具有內皮細胞選擇性聚乙二醇類二元共聚物溶于四氫呋喃溶劑中，配置成 質量濃度為〇. 01~5 %的溶液，并用超聲處理，得到溶解均勻的溶液C;
[0026] (b)將基材依次用丙酮、甲醇、三蒸水超聲預處理10~30分鐘；
[0027] (c)取1，6-己二胺固體溶解于無水乙醇中，配制成10wt %的溶液，將預先處理好的 基材浸入1，6_己二胺溶液中，并在常溫下反應24h，然后用三蒸水沖洗3遍，N2吹干，保存備 用；
[0028] (d)采用浸涂法將溶液C涂覆在步驟(c)處理過的基材表面；
[0029] (e)將已涂覆材料的基材表面用氮氣吹干后，浸入質量濃度為0.01~0.5%生物活 性分子的磷酸鹽緩沖液，在4~25 °C下反應24~72h，用賴氨酸的PBS溶液封端，真空干燥，得 到內皮細胞選擇性聚乙二醇類復合涂層。
[0030] 步驟(C)是承上啟下的關鍵一步。通過該步驟，使預處理過的基底膜上共價修飾氨 基基團，然后涂層材料(二元共聚物）中的環氧基團可以和修飾在表面上的氨基反應，使涂 層材料接枝在基底膜表面。
[0031] 優選的，步驟(b)的處理方法為：用體積比為7: 3的濃硫酸和雙氧水熱預處理30~ 60分鐘，再用三蒸水沖洗。
[0032] 本發明與現有技術相比具有的有益效果是：
[0033] 1)聚合物合成方法簡單，僅需兩種單體聚合而成；
[0034] 2)合成的聚合物具有良好的反應活性，有利于生物分子的固定，可以保持支架表 面的非特異性阻抗性能，同時實現體內原位內皮細胞捕獲能力，且得到的涂層結構穩定；
[0035] 3)所固定生物分子范圍廣泛，包括多肽以及抗體，選擇范圍寬；
[0036] 4)復合涂層中細胞糖質衣仿生單體和生物分子的協同作用可以有效防止再狹窄 和血栓發生同時促進表面內皮化的形成，對現有心血管支架的內皮化不足進行很好的改 進。
【附圖說明】
[0037] 圖1是PEGMA-GMA的核磁結構譜圖；其中（a)n = 19，（b)n = 6;
[0038] 圖2是PEGMA(n = 19)-GMA-REDV的復合涂層結構示意圖；
[0039] 圖3是PEGMA(n = 6)-GMA-RGD的復合涂層結構示意圖；
[0040] 圖4是PEGMA(n = 19)-GMA-REDV復合涂層的內皮細胞和平滑肌細胞增殖對比圖；
[0041 ]圖5是PEGMA(n = 6)-GMA-RGD復合涂層的內皮細胞和平滑肌細胞增殖對比圖。
【具體實施方式】
[0042]下面通過實施例對本發明作詳細描述，如無特殊說明，下述實施例中涉及的化學 試劑均市售可得。
[0043] 實施例1
[0044] (1)制備內皮細胞選擇性聚乙二醇類二元共聚物
[0046] (1.1)將0.5g細胞糖質衣仿生的生物相容性單體PEGMA(n= 19)、1.5g含可反應活 性功能基團的可聚合單體GMA用30ml乙醇溶解，得到溶液A;
[0047] (1.2)將0.04g引發劑AIBN加入到溶液A中，得到溶液B;
[0048] (1.3)用氬氣對溶液B除氧30分鐘，加熱到60°C，反應24小時；
[0049] (1.4)減壓除溶劑，冰乙醚沉析2次，得到具有內皮細胞選擇性聚乙二醇類二元共 聚物PEGMA-GMA。核磁結果證實所獲得的產物具有預期的結構。如圖1 (a)所示。
[0050] (2)制備內皮細胞選擇性聚乙二醇類復合涂層
[00511 (2.1)將具有內皮細胞選擇性聚乙二醇類二元共聚物PEGMA-GMA溶于四氫呋喃溶 劑中，配置成質量濃度為0.05%的溶液，并用超聲處理，得到溶解均勻的溶液C;
[0052] (2.2)將PET基底膜依次用丙酮、甲醇、三蒸水超聲預處理30分鐘，三蒸水沖洗；
[0053] (2.3)取適量1，6_己二胺固體溶解于無水乙醇中，配制成10%的溶液，將預先處理 好的PET基底膜浸入到10%的1，6_己二胺溶液中，并在常溫下反應