人乳頭瘤病毒58型單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及分子病毒學和免疫學領域，具體而言，本發明涉及人乳頭瘤病毒58型 雜交瘤細胞系及其產生的單克隆抗體以及編碼它們的序列，和它們進行診斷、預防和治療 的應用。
【背景技術】
[0002] 人乳頭瘤病毒(HPV)是無包膜的雙鏈小DNA病毒，主要侵及人的上皮組織，進而誘 發各種良、惡性增生病變。高危型HPV感染與多種惡性腫瘤的發生相關，低危型的HPV感染則 弓丨起肛門和生殖疣。HPV感染的流行范圍廣，所引發的相關致死性的惡性腫瘤和多種性傳播 疾病對人類健康具有嚴重的危害性，開發安全有效的預防或治療性疫苗具有重大意義。
[0003] HPV病毒顆粒直徑為55~60nm，核衣殼呈20面體對稱，由72個主要衣殼蛋白L1的五 聚體及次要衣殼蛋白L2組成。大量研究證實，HPV L1蛋白是HPV疫苗的主要靶蛋白。在多種 表達系統中表達的HPV L1蛋白無需L2蛋白輔助即可形成在形態結構與天然病毒顆粒相似 的類病毒顆粒(Virus-LlkeParticle，VLP)。重組HPV L1-VLP疫苗已經成功上市并用于預防 HPV感染及由此導致的宮頸癌、尖銳濕疣等疾病，并充分證明了 L1-VLP具有與野生同型病毒 相同的抗原性和免疫原性，其結構與天然HPV高度相似，保留了天然病毒的絕大多數中和表 位，可誘導高滴度的中和抗體。
[0004] 國家食品藥品監督管理局（croA)在《預防用疫苗臨床前研究技術指導原則》中指 出："在生產工藝的各個環節和步驟中的產品均應建立相應的監控標準，以便后續工藝的進 行，保證產品的質量、工藝的穩定性"，同時要求"在半成品和成品階段的質量控制至少包括 鑒別試驗" 在HPV疫苗研發過程中，需要開展四個方面的測定，即型別鑒定實驗、抗原含量檢測和 體外效力測定。其方法均可以采用雙抗體夾心法ELISA。因此，在疫苗研究中，單克隆抗體是 疫苗抗原質控的重要工具，尤其是具有特異性和中和活性的抗體在疫苗研發中具有不可替 代的作用。
[0005] 目前國外已上市的人乳頭瘤病毒疫苗主要有三種，分別是：2006年首次上市的由 16、18、6和11型人乳頭瘤病毒11重組蛋白構成的四價疫苗(6 &"&811)，2007年首次上市的 由16和18型乳頭瘤病毒L1重組蛋白構成的二價疫苗(Cervarix)，以及2014年12月首次上市 的由6、11、16、18、31、33、45、52和58型人乳頭瘤病毒11重組蛋白構成的九價疫苗(6 &"&811 9)。本發明提供了最多可針對九價范圍內HPV58的特異性和中和活性的單克隆抗體，利用其 中的兩株制備的ELISA檢測試劑盒，可以特異性地用于快速鑒別并定量HPV58 L1蛋白，可以 廣泛應用于臨床檢測和目前疫苗廠家生產疫苗過程中的質檢，對女性的健康發展和公共衛 生防控將具有重要的意義。
【發明內容】
[0006] 本發明的第一個目的是提供能夠識別HPV58的單克隆抗體以及產生該抗體的雜交 瘤細胞系。
[0007]本發明的第二個目的是提供一種用于檢測HPV58的雙抗體夾心ELISA試劑盒。
[0008]本發明的第三個目的在于提供單克隆抗體的制備方法。
[0009] 本發明的第四個目的在于提供HPV的抗原檢測試劑盒的制備方法。
[0010] 本發明實驗目的是通過如下技術方案實現： 本發明提供的單克隆抗體，其是以HPV58 L1五聚體蛋白作為免疫原，制備獲得。具體地 說是HPV58 L1五聚體蛋白作為免疫原免疫小鼠，采用雜交瘤技術經過細胞融合并篩選得到 能持續、穩定分泌抗HPV58 L1的雜交瘤細胞株，由各細胞株分泌得到單克隆抗體。
[0011] 在一個優選的實施方案中識別人乳頭瘤病毒58型L1蛋白的單克隆抗體，由雜交瘤 細胞株2F7產生，其保藏編號:CGMCC No. 11295;分類命名：雜交瘤細胞;保藏單位名稱：中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路1號院 3號;保藏日期：2015年10月30日。
[0012] 本發明公開的單克隆抗體2F7,包含至少1個抗體重鏈可變區和至少1個抗體輕鏈 可變區，并且其中所述抗體輕鏈可變區具有⑶R序列⑶RL1、⑶RL2或/和⑶RL3，其中： CDRL1 包括SEQ ID N0:1; CDRL2包括SEQ ID N0:2; CDRL3包括SEQ ID N0:3。
[0013] 抗體重鏈可變區具有選自⑶RH1、⑶RH2或/和⑶RH3，其中： CDRH1 包括SEQ ID N0:4; CDRH2包括SEQ ID N0:5; CDRH3包括SEQ ID N0:6。
[0014] 在一個優選的實施方案中人乳頭瘤病毒58型LI蛋白的單克隆抗體或抗原結合片 段，包含至少1個抗體輕鏈可變區包括SEQ ID N0:7和至少1個抗體重鏈可變區包括SEQ ID N0:8〇
[0015] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種分離的核酸，該核酸編碼本發明抗體的 至少一個輕鏈可變區SEQ ID N0:7和重鏈可變區SEQ ID N0:8。
[0016] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種核酸的表達載體，該載體轉染宿主細胞 時所述核酸與宿主細胞識別的控制序列有效連接。
[0017] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種表達載體的宿主細胞。
[0018] 在一個優選的實施方案中本發明提供另一種人乳頭瘤病毒58型L1蛋白的單克隆 抗體，其特征在于該單克隆抗體由雜交瘤細胞株2G7產生，其保藏編號:CGMCC No. 11296;分 類命名：雜交瘤細胞;保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;保 藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號;保藏日期:2015年10月30日。
[0019] 由雜交瘤細胞株2G7產生的單克隆抗體，包含至少1個抗體重鏈可變區和至少1個 抗體輕鏈可變區，并且其中所述抗體輕鏈可變區具有⑶R序列⑶RL1XDRL2或/和⑶RL3,其 中： CDRL1 包括SEQ ID N0:9; CDRL2包括SEQ ID N0:10; CDRL3包括SEQ ID N0:11。
[0020] 由雜交瘤細胞株2G7產生的單克隆抗體的重鏈可變區具有選自⑶RH1、⑶RH2或/和 CDRH3,其中： CDRH1 包括SEQ ID N0:12; CDRH2包括SEQ ID N0:13; CDRH3包括SEQ ID N0:14。
[0021] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種識別人乳頭瘤病毒58型LI蛋白的單克 隆抗體或抗原結合片段，其特征在于其中包含至少1個抗體輕鏈可變區包括SEQ ID N0:15 和至少1個抗體重鏈可變區包括SEQ ID NO: 16。
[0022] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種分離的核酸，其編碼本發明抗體的至少 一個輕鏈可變區SEQ ID N0:15和重鏈可變區SEQ ID N0:16。
[0023] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種核酸的表達載體，其載體轉染宿主細胞 時所述核酸與宿主細胞識別的控制序列有效連接。
[0024] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種包括表達載體的宿主細胞。
[0025]另一方面本發明提供一種檢測HPV58 L1的試劑盒，包括本發明公開的單克隆抗體 或抗原結合片段。
[0026]本發明公開的檢測HPV58 L1的試劑盒，還包括可檢測的標記:放射性同位素、焚光 物質、發光物質、有色物質和/或酶。
[0027]另一方面本發明提供一種檢測一種特異性檢測人乳頭瘤病毒58型