方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種用于修飾模板雙鏈多核巧酸的方法，尤其設及一種使用納米孔測 序進行表征的方法。所述方法從多個修飾的雙鏈多核巧酸模板化而產生。運些修飾的多核 巧酸可W隨后被表征。
【背景技術】
[0002] 許多商業情況需要制備核酸文庫。運通常使用轉座酶而實現。根據制備該文庫所 使用的轉座酶，在該文庫可能需要在使用前，如在測序使用中前，在體外對易位事件 (transposition events)進行修復。
[0003] 目前需要一種具有廣泛的應用范圍的快速且廉價的多核巧酸(如DNA或RNA)測序 和鑒定技術。現有的技術是緩慢的且昂貴的，運主要由于它們依賴于擴增技術W產生大量 的多核巧酸，且需要大量特定的用于信號檢測的巧光化學物質。
[0004] 跨膜孔(納米孔)作為用于聚合物和各種小分子的直接的、電生物傳感器，具有很 大的潛力。特別是，目前作為一種有潛力的DNA測序技術的納米孔得到了許多關注。
[0005] 當跨納米孔施加電勢時，在特定的時間段內，當分析物如核巧酸片刻停留在桶 (barrel)中時，會產生電流的變化。所述核巧酸的納米孔檢測能產生已知特征和持續時間 的電流變化。在鏈測序方法中，單個多核巧酸鏈穿過所述孔并能實現對核巧酸的鑒定。鏈測 序可包括使用多核巧酸結合蛋白，W控制所述多核巧酸穿過所述孔的移動。
【發明內容】
[0006] 本發明已令人驚訝地表明可W修飾模板雙鏈多核巧酸W產生多個較短且修飾的 雙鏈多核巧酸。所述雙鏈多核巧酸可包括，例如，發夾環或單鏈前導序列。運些修飾可W被 設計，使得修飾的雙鏈多核巧酸各自比原來的模板多核巧酸更易于表征，例如通過鏈測序。 所述修飾的多核巧酸的隨后的表征允許模板多核巧酸的特點更容易被確定。
[0007] 在一個實施例中，修飾方法使用MUA轉座酶和MuA底物組，每個底物包含通用核巧 酸突出。通用核巧酸是與模板多核巧酸中的所有核巧酸都有一定程度雜交的核巧酸。MuA轉 座酶能夠將模板多核巧酸片段化且產生在兩端具有突出的片段。MUA轉座酶還能夠將所述 底物連接到所述雙鏈片段的一端或兩端的突出。不具有突出的底物的鏈通常被連接到具有 突出的片段的鏈。運使得在得到的雙鏈構建體中有單鏈缺口。令人驚奇的是，含有通用核巧 酸的底物中的突出能夠雜交到所述片段的鏈中的突出（底物中沒有突出的反義鏈連接其 上），并通過轉座酶的作用閉合留下的缺口（見圖1)。將所述突出連接到所述片段中相鄰的 鏈，產生了修飾的雙鏈多核巧酸。
[000引因此，本發明提供了用于修飾模板雙鏈多核巧酸的方法，包括：
[0009] (a)將模板多核巧酸與MuA轉座酶和雙鏈MuA底物組接觸，每個所述底物含有至少 一個通用核巧酸突出，使得所述轉座酶將所述模板多核巧酸片段化并將底物連接到雙鏈片 段的一端或兩端，并由此制備多個片段/底物構建體;W及
[0010] (b)將所述突出連接到所述構建體中的所述片段，并由此制備多個修飾的雙鏈多 核巧酸。在另一個實施例中，該修飾方法使用MuA轉座酶和MuA轉座酶底物組，每個底物包括 至少一個突出W及與所述突出在相同的鏈中的至少一個核巧酸，所述核巧酸包含在所述模 板多核巧酸中不存在的核巧酸。所述MuA轉座酶能夠將所述模板多核巧酸片段化。還能夠將 底物連接到雙鏈片段的一端或兩端。使用所述至少一個核巧酸將所述突出從連接的構建體 中特定的除去，所述至少一個核巧酸包含在模板多核巧酸中不存在的核巧酸。運在雙鏈片 段中留下了缺口，且修復運些缺口提供了多個修飾的雙鏈多核巧酸。
[0011] 因此，本發明還提供了用于修飾模板雙鏈多核巧酸的方法，包括：
[0012] (a)將模板多核巧酸與MuA轉座酶和雙鏈MuA底物組接觸，每個所述底物包含（i)至 少一個突出W及（ii)與所述至少一個突出在相同的鏈中的至少一個核巧酸，所述至少一個 核巧酸包含在所述模板多核巧酸中不存在的核巧酸，使得所述轉座酶將所述模板多核巧酸 片段化并將底物連接到雙鏈片段的一端或兩端，并由此制備多個片段/底物構建體；
[0013] (b)通過選擇性地除去所述至少一個核巧酸將所述突出從所述構建體中除去，并 由此制備多個包含單鏈缺口的雙鏈構建體;W及
[0014] (C)修復在所述構建體中所述單鏈缺口，并由此制備多個修飾的雙鏈多核巧酸。 [001引本發明還提供：
[0016] -使用本發明方法修飾的多個多核巧酸。
[0017] -用于修飾模板多核巧酸的雙鏈多核巧酸底物組，其中所述底物如上文所定義：
[0018] --種表征使用本發明的方法修飾的至少一個多核巧酸的方法，包括a)將所述修 飾的多核巧酸與跨膜孔接觸，使得所述多核巧酸的至少一條鏈移動穿過所述孔；W及b)隨 著所述至少一條鏈相對于所述孔移動，獲取一個或多個測量值，其中所述測量值代表所述 至少一條鏈的一個或多個特征，并由此表征所述修飾的多核巧酸。
[0019] --種表征模板多核巧酸的方法，包括a)使用本發明的方法修飾所述模板多核巧 酸，W產生多個修飾的多核巧酸;b)將每個修飾的多核巧酸與跨膜孔接觸，使得每個多核巧 酸的至少一條鏈移動穿過所述孔；W及C)隨著每個多核巧酸的至少一條鏈相對于所述孔移 動，獲取一個或多個測量值，其中所述測量值代表每個多核巧酸的至少一條鏈的一個或多 個特征，并由此表征所述模板多核巧酸。
[0020] --種用于修飾模板多核巧酸的試劑盒，包含(a)如上定義的MuA底物組W及(b) MuA轉座酶。
【附圖說明】
[0021] 圖1示出了修飾模板雙鏈多核巧酸的鏈(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a) 的鏈與MuA轉座酶(b)和雙鏈MuA底物組（C)接觸。雙鏈MuA底物每個含有5/憐酸（標記為圓 圈）和五個通用核巧酸(標記為矩形KMuA轉座酶將模板雙鏈多核巧酸片段化，并在片段化 的位點的每一側插入MuA底物(步驟1)。在片段化的雙鏈構建體中留下的缺口隨后使用DNA 連接酶(d)修復，該連接酶將含有通用核巧酸的鏈連接到雙鏈構建體(步驟2)。
[0022] 圖2示出了修飾模板雙鏈多核巧酸的鏈(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a) 的鏈與MuA轉座酶(b)和雙鏈發夾形MuA底物組(C)接觸。發夾形MuA底物每個含有5/憐酸(標 記為圓圈）和五個通用核巧酸(標記為矩形KMuA轉座酶將模板雙鏈多核巧酸片段化，并在 片段化的位點的每一側插入MuA底物(步驟I)。在片段化的雙鏈構建體中留下的缺口隨后使 用DNA連接酶(d)修復，該連接酶將含有通用核巧酸的鏈連接到雙鏈構建體(步驟2)。
[0023] 圖3示出了修飾模板雙鏈多核巧酸的鏈(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a) 的鏈與MuA轉座酶(b)和Y-形MuA底物組（C)接觸。Y-形MuA底物每個含有5/憐酸（標記為圓 圈）和五個通用核巧酸(標記為矩形KMuA轉座酶將模板雙鏈多核巧酸片段化，并在片段化 的位點的每一側插入Y-形MuA底物(步驟1)。在片段化的雙鏈構建體中留下的缺口隨后使用 DNA連接酶(d)修復，該連接酶將含有通用核巧酸的鏈連接到雙鏈構建體(步驟2)。
[0024] 圖4示出了修飾模板雙鏈多核巧酸的鏈(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a) 的鏈與MuA轉座酶(b )、雙鏈發夾形MuA底物(d )、Y-形MuA底物(C)的組接觸。兩種MuA底物每 個含有5/憐酸(標記為圓圈）和五個通用核巧酸(標記為矩形KMuA轉座酶將模板雙鏈多核 巧酸片段化，并在片段化的位點的每一側插入MuA底物(步驟1)。在片段化的雙鏈構建體中 留下的缺口隨后使用DNA連接酶(e)修復，該連接酶將含有通用核巧酸的鏈連接到雙鏈構建 體(步驟2)。
[0025] 圖5示出了修飾模板雙鏈多核巧酸的鏈(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a) 的鏈與MuA轉座酶(b )、雙鏈發夾形MuA底物(d )、Y-形MuA底物(C)的組接觸。兩種MuA底物每 個含有5/憐酸(標記為圓圈）和五個通用核巧酸(標記為矩形KMuA轉座酶將模板雙鏈多核 巧酸片段化，并在片段化的位點的每一側插入MuA底物(步驟1)。在片段化的雙鏈構建體中 留下的缺口隨后使用DNA連接酶(e)修復，該連接酶將含有通用核巧酸的鏈連接到雙鏈構建 體(步驟2)。
[0026] 圖6示出了修飾模板雙鏈多核巧酸(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a)的鏈 與MuA轉座酶(b )、雙鏈發夾形MuA底物組(d )、Y-形MuA底物(C)的組接觸。Y-形MuA底物具有 附加的POlyT前導序列(標記為不連續的波浪線）。兩種MuA底物每個含有5/憐酸(標記為圓 圈）和五個通用核巧酸(標記為矩形KMuA轉座酶將模板雙鏈多核巧酸片段化，并在片段化 的位點的每一側插入MuA底物(步驟1)。在片段化的雙鏈構建體中留下的缺口隨后使用DNA 連接酶(e)修復，該連接酶將含有通用核巧酸的鏈連接到雙鏈構建體(步驟2)。
[0027] 圖7示出了修飾模板雙鏈多核巧酸(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a)的鏈 與MuA轉座酶(b)和雙鏈MuA底物組(C)的組接觸。發夾環MuA底物每個含有5/憐酸(標記為圓 圈）和五個通用核巧酸(標記為矩形KMuA轉座酶將模板雙鏈多核巧酸片段化，并在片段化 的位點的每一側插入MuA底物(步驟1)。在片段化的雙鏈構建體中留下的缺口隨后使用DNA 連接酶(d)修復，該連接酶將含有通用核巧酸的鏈連接到雙鏈構建體(步驟2)。
[0028] 圖8示出了修飾模板雙鏈多核巧酸(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a)的鏈 與MuA轉座酶(b)和雙鏈MuA底物組(C)接觸。雙鏈MuA底物含有標記為S角形的在模板多核 巧酸中不存在的單核巧酸。MuA轉座酶將模板雙鏈多核巧酸片段化，并在片段化的位點的每 一側插入MuA底物(步驟1)。尿喀晚特異性切除試劑化racU-specific Excision Reagent) (USER?)在模板多核巧酸中不存在的該單核巧酸的位置(=角形)產生單核巧酸缺口，使得 含有在模板多核巧酸中不存在的該單核巧酸的DNA片段被除去(步驟2)。留在片段化的雙鏈 構建體中的單鏈DNA缺口隨后使用DNA聚合酶(e)修復，其用合適的互補核巧酸填充了該缺 口，且DNA連接酶(f)將新合成的鏈連接到含有單一缺口的雙鏈構建體(步驟3)。
[0029] 圖9示出了修飾模板雙鏈多核巧酸(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a)的鏈 與MuA轉座酶(b)和雙鏈發夾形MuA底物組(C)接觸。雙鏈發夾形MuA底物含有標記為S角形 的在模板多核巧酸中不存在的單核巧酸。MuA轉座酶將模板雙鏈多核巧酸片段化，并在片段 化的位點的每一側插入MuA底物(步驟1)。尿喀晚特異性切除試劑化SER?)在模板多核巧酸 中不存在的該單核巧酸的位置(=角形)產生單核巧酸缺口，使得含有在模板多核巧酸中不 存在的該單核巧酸的DNA片段被除去（步驟2)。留在片段化的雙鏈構建體中的單鏈DNA缺口 隨后使用DNA聚合酶(e)修復，其用合適的互補核巧酸填充該缺口，且DNA連接酶(f)將新合 成的鏈連接到含有單一缺口的雙鏈構建體(步驟3)。
[0030] 圖10示出了修飾模板雙鏈多核巧酸(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a)的鏈 與MuA轉座酶(b)和Y-形MuA底物組(C)接觸。Y-形MuA底物含有標記為S角形的在模板多核 巧酸中不存在的單核巧酸。MuA轉座酶將模板雙鏈多核巧酸片段化，并在片段化的位點的每 一側插入Y-形MuA底物(步驟1)。尿喀晚特異性切除試劑化SER?)在模板多核巧酸中不存在 的該單核巧酸的位置(=角形)產生單核巧酸缺口，使得含有在模板多核巧酸中不存在的該 單核巧酸的DNA片段被除去（步驟2)。留在片段化的雙鏈構建體中的單鏈DNA缺口隨后使用 DNA聚合酶(e)修復，其用合適的互補核巧酸填充了該缺口，且DNA連接酶(f)將新合成的鏈 連接到含有單一缺口的雙鏈構建體(步驟3)。
[0031] 圖11示出了修飾模板雙鏈多核巧酸(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a)的鏈 與MuA轉座酶(b )、雙鏈發夾形MuA底物(d )、Y-形MuA底物(C)的組接觸。兩種MuA底物含有標 記為S角形的在模板多核巧酸中不存在的單核巧酸。MuA轉座酶將模板雙鏈多核巧酸片段 化，并在片段化的位點的每一側插入MuA底物(步驟1)。尿喀晚特異性切除試劑化SER?)在模 板多核巧酸中不存在的任何單核巧酸的位置(=角形)產生單核巧酸缺口，使得含有在模板 多核巧酸中不存在的該單核巧酸的DNA片段(e)被除去(步驟2)。留在片段化的雙鏈構建體 中的單鏈DNA缺口隨后使用DNA聚合酶(f)修復，其用合適的互補核巧酸填充了該缺口，且 DNA連接酶(g)將新合成的鏈連接到含有單一缺口的雙鏈構建體(步驟3)。
[0032] 圖12示出了修飾模板雙鏈多核巧酸(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a)的鏈 與MuA轉座酶(b )、雙鏈發夾形MuA底物(d )、Y-形MuA底物(C)的組接觸。兩種MuA底物含有標 記為S角形的在模板多核巧酸中不存在的單核巧酸。MuA轉座酶將模板雙鏈多核巧酸片段 化，并在片段化的位點的每一側插入MuA底物(步驟1)。尿喀晚特異性切除試劑化SER?)在模 板多核巧酸中不存在的任何單核巧酸的位置(=角形)產生單核巧酸缺口，使得含有在模板 多核巧酸中不存在的該單核巧酸的DNA片段(e)被除去(步驟2)。留在片段化的雙鏈構建體 中的單鏈DNA缺口隨后使用DNA聚合酶(f)修復，其用合適的互補核巧酸填充了該缺口，且 DNA連接酶(g)將新合成的鏈連接到含有單一缺口的雙鏈構建體(步驟3)。
[0033] 圖13示出了修飾模板雙鏈多核巧酸(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a)的鏈 與MuA轉座酶(b )、雙鏈發夾形MuA底物(d )、Y-形MuA底物(C)的組接觸。Y-形MuA底物具有附 加的聚T前導序列（顯示為不連續的波浪線）。兩種MuA底物含有標記為=角形的在模板多核 巧酸中不存在的單核巧酸。MuA轉座酶將模板雙鏈多核巧酸片段化，并在片段化的位點的每 一側插入MuA底物(步驟1)。尿喀晚特異性切除試劑(USER?)在模板多核巧酸中不存在的任 何單核巧酸的位置(=角形)產生單核巧酸缺口，使得含有在模板多核巧酸中不存在的該單 核巧酸的DNA片段(e)被除去(步驟2)。留在片段化的雙鏈構建體中的單鏈DNA缺口隨后使用 DNA聚合酶(f)修復，其用合適的互補核巧酸填充了該缺口，且DNA連接酶(g)將新合成的鏈 連接到含有單一缺口的雙鏈構建體(步驟3)。
[0034] 圖14示出了修飾模板雙鏈多核巧酸(a)的方法，通過將模板雙鏈多核巧酸(a)的鏈 與MuA轉座酶(b)和雙鏈發夾形MuA底物組(C)接觸。發夾環MuA底物含有標記為S角形的在 模板多核巧酸中不存在的單核巧酸。MuA轉座酶將模板雙鏈多核巧酸片段化，并在片段化的 位點的每一側插入MuA底物(步驟1)。尿喀晚特異性切除試劑化SER?)在模板多核巧酸中不 存在的任何單核巧酸的位置(=角形)產生單核巧酸缺口，使得含有在模板多核巧酸中不存 在的該單核巧酸的DNA片段(d)被除去(步驟2)。留在片段化的雙鏈構建體中的單鏈DNA缺口 隨后使用DNA聚合酶(f)修復，其用合適的互補核巧酸填充了該缺日，且DNA連接酶(g)將新 合成的鏈連接到含有單一缺口的雙鏈構建體(步驟3)。
[0035] 圖15示出在實施例1中使用用于兩個MuA底物的DNA底物的設計(MuA底物1標記為 A，MuA底物2標記為B)。沈Q ID N0:26中的dUMP高亮為星型，C3間隔區顯示為x's。
[0036] 圖16示出與W下樣品相關的凝膠中的泳道-泳道1 =適當的DNA梯(DNA標記物的單 位為化），泳道2與樣品1對應(對照，顯示由未修飾的SEQ ID N0:29產生的帶），泳道3與樣品 2對應（野生型MuA底物(MUA底物1，通過4個C3間隔區單元連接到SEQ ID NO: 24的SEQ ID N0:27,與SEQ ID N0:28雜交)不含在模板多核巧酸(SEQ ID N0:29)中不存在的至少一個核 巧酸），泳道4與樣品3對應(含有加 MP的MuA底物(MuA底物2,通過4個C3間隔區單元連接到 沈Q ID N0:24的SEQ ID N0:27,與沈Q ID N0:26雜交），其在模板多核巧酸(SEQ ID N0:29) 中不存在），泳道5與樣品4對應(在凝膠上的寬帶表明MuA轉座酶能夠將野生型MuA底物(通 過4個C3間隔區單元連接于沈Q ID N0:24的沈Q ID N0:27,與沈Q ID N0:28雜交)插入到模 板多核巧酸(SEQ ID NO: 29)中），泳道6與樣品5對應(在凝膠上的寬帶表明MuA轉座酶能夠 將含有加 MP的MuA底物（SEQ ID N0:27通過4個C3間隔區單元連接到SEQ ID N0:24,與SEQ ID N0:26雜交)插入到模板多核巧酸（SEQ ID N0:29))。泳道3和泳道4作為額外的對照運 行，在凝膠的底部產生模糊的帶。
[0037] 圖17A)部分顯示出實施例2中描述的樣品制備方法。在步驟1中的多個ssDNA片段 退火W形成模型構建體(X)。步驟2示出使用USER?從構建體X(標記為S角形）中除去dUMP。 最后，在步驟帥構建體X中的缺口使用DNA聚合酶和連接酶修復，W產生ds-DNA多核巧酸， B)部分示出對照鏈，其中SEQ ID NO:30退火到其互補鏈SEQ ID NO:33。
[003引圖18示出安捷倫1000忍片，具有包含在泳道1-9如下樣品，-泳道1=合適的DNA梯， 泳道2 =對照樣品a(含構建體Y，未消化），泳道3 =對照樣品b(含消化后的構建體Y)，泳道4 =對照樣品C(含未暴露于聚合酶或連接酶的構建體X，未消化），泳道5 =對照樣品d(含在消 化后未暴露于聚合酶或連接酶的構建體X)，泳道6 =對照樣品e(含僅暴露于聚合酶的構建 體X，未消化），泳道7 =對照樣品f(含僅暴露于聚合酶的構建體X，消化后），泳道8 =對照樣 品g(含暴露于聚合酶和連接酶的構建體X，未消化），泳道9 =對照樣品h(包含未暴露于聚合 酶和連接酶的構建體X，消化后）。用星號標記的條帶對應于未消化的dsDNA構建體，用正方 形標記的條帶對應于消化的DNA。
[0039]圖19示出在實施例3中使用的樣品制備過程的卡通表示。在步驟1中所述雙鏈是A DNA(SEQ ID NO: 29,標記為a)與MuA轉座酶(b)、雙鏈發夾形MuA底物組(d)和Y-形MuA底物 (C)接觸。兩種類型的MuA底物含有標記為S角形的單dUMP。該MuA轉座酶將ADNA片段化為5-IOkB的片段，并將MuA底物插入到片段化的位點的每側（步驟1)。尿喀晚特異性切除試劑 USERTM在任何加 MPs(S角形）的位置處產生單核巧酸缺口，運使含有加 MP(e)的DNA片段被 除去(步驟2)。留在片段化的雙鏈構建體中的單鏈DNA缺口隨后使用DNA聚合酶(f)修復，用 合適的互補核巧酸填充了該缺口，且DNA連接酶(g)將新合成的鏈連接到含有單一鏈缺口的 雙鏈構建體(步驟3)。在步驟4中，得到的ADNA構建體化)然后在解旋酶(j)的控制下易位穿 過納米孔(i)。
[0040] 圖20(a)顯示了實施例3中使用的發夾形MuA底物和Y-形MuA底物的設計。SEQ ID NO: 36中的dUMP被突出顯示為S角形且所述iSpC3間隔區顯示為S。圖20(b)顯示了實施例 3中詳述的樣品制備過程中制備的ADNA構建體。ADNA構建體的5-lOkB片段標記為X，由聚合 酶插入并由連接酶結合到該構建體的其余部分的DNA片段標記為y(且W點線示出），且所述 iSpC3間隔區顯示為X。連接體序列（tether sequence) (SEQ ID NO: 39)與所示DNA構建體雜 交。在SEQ ID NO: 39的y末端連接6個i Sp 18間隔區，該6個i Sp 18間隔區連接到2個胸腺喀晚 殘基和y膽固醇TEG(顯示為灰色圓圈）。
[0041 ] 圖21顯示了當解旋酶(Trwc Cba(SEQ ID NO:40,由標記A)控制的ADNA構建體(如 圖20(b)中所示）穿過納米孔(MS(Bl-G75S/G77S/L88N/Q126R)8MspA(具有突變G75S/G77S/ L88N/Q126R的SEQ ID NO: 2))的易位時的示例電流軌跡(廠軸坐標=電流(pA)，X-軸坐標= 時間（S)，對于上軌跡和下軌跡）。上軌跡顯示了由解旋酶控制的整個ADNA構建體穿過納米 孔的DNA移動，標記為Xl的第一個iSpC3間隔區產生的標記為1的電流的尖峰，標記為X2的第 二個iSpC3間隔區產生的標記為2的電流的尖峰。下軌跡顯示了由解旋酶控制的DNA移動穿 過納米孔的終點的放大的區域，標記為X3的第S個iSpC3產生的標記為3的電流的尖峰。
[0042] 圖22示出在實施例3中使用的樣品制備過程的卡通表示。在步驟1中所述雙鏈是A DNA(SEQ ID NO: 29，標記為a)與MuA轉座酶(b)、雙鏈發夾形2MuA底物組(d)和Y-形2MuA底物 (C)接觸。兩種類型的MuA底物含有5'憐酸(標記為圓形)和5個肌巧(標記為矩形KMuA轉座 酶將ADNA片段化為5-lOkB的片段，并將MuA底物插入到片段化的位點的每側（步驟1)。留在 片段化的雙鏈構建體中的缺口隨后使用DNA連接酶(e)修復，該連接酶將包含肌巧的鏈連接 到雙鏈ADNA構建體(步驟2)。在步驟帥，得到的ADNA構建體(f)在解旋酶(g)的控制下易位 穿過納米孔化）。
[0043] 圖23(a)顯示了在實施例4中使用的發夾形2和Y-形MuA底物設計。5/憐酸標記為圓 形，SEQ ID N0:41中的肌巧突出顯示為矩形，iSpC3間隔區顯示為X。圖23(b)顯示了實施例4 中所述的樣品制備過程中制備的WNA構建體。ADNA構建體的5-1 OkB片段標記為X，已被連接 至Ijx的肌巧標記為矩形，iSpC3間隔區顯示為X。連接體序列（SEQ ID N0:39)與所示DNA構建 體雜交。SEQ ID N0:39的y末端連接6個iSpl8間隔區，該6個iSpl8間隔區連接到2個胸腺喀 晚殘基和y膽固醇TEG(顯示為灰色圓圈）。
[0044] 圖24顯示了當解旋酶(Trwc化a(SEQ ID N0:40,由標記的A)控制的ADNA構建體穿 過納米孔(MS(B1-G75S/G77S/L88N/Q126R)8的MspA(SEQ ID ^:2具有突變6755/6775/ L88N/Q126R))易位時的示例電流軌跡(廠軸坐標=電流(pA)，X-軸坐標=時間（S)，對于上 軌跡和下軌跡）。上軌跡顯示了由解旋酶控制的整個ADNA構建體穿過納米孔的DNA移動，標 記為Xl的第一個iSpC3間隔區產生標記為1的電流的尖峰，標記為X2的第二個iSpC3間隔區 產生的標記為2電流中的尖峰，標記為X3的第S個iSpC3間隔區產生的標記為3的電流的尖 峰。下軌跡顯示了由解旋酶控制的DNA移動穿過納米孔的后半部分放大的區域，標記為X2的 第二個iSpC3間隔區產生標記為2的電流的尖峰，標記為X3的第S個iSpC3間隔區產生的標 記為3的電流的尖峰。
[0045] 序列表的說明
[0046] SEQ ID NO: 1顯示了編碼MS-Bl突變體MspA單體的密碼子優化的多核巧酸序列。該 突變體缺少信號序列，并包含下列突變:D90N，D91N，D93N，D118R，D134R和E139K。
[0047] SEQ ID N0:2顯示了由MspA單體的MS-Bl突變體的成熟形式的氨基酸序列。該突變 體缺少信號序列，并包含下列突