一種聚合級乳酸單體生產菌及其構建方法與乳酸制造技術的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及微生物應用領域，尤其是一種聚合級乳酸單體生產菌及其構建方法與 乳酸制造技術。
【背景技術】
[0002] 生物可降解材料是指其使用后的廢棄物能夠被環境(微)生物所降解和利用的一 類新穎材料。新一代生物可降解材料W聚乳酸為代表，分為聚心乳酸和聚D-乳酸，分別通過 其單體k乳酸或D-乳酸聚合而得。預計到2020年，全球聚乳酸的年需求量將達到1500萬噸， 并且是年需求達5,000萬噸的聚對苯二甲酸乙二醇醋。〇17日1：115^16]16 16'6地1：11曰1曰16,陽1') 和聚苯乙締(Polystyrene, PS)的最可能的替代品。
[0003] W高品質D-乳酸為原材料聚合而成的聚D-乳酸材料可W很好的替代普通化工產 品聚合而成的纖維、塑料等制品。特別是在高端消費品領域，如尿不濕內置墊片，香煙過濾 頭等材料加工聚合方面，其獨特的生物質材料特性、生物體相容性和無毒無害特性大幅度 提升相關產品的品質，市場空間巨大。W聚D-乳酸為原料采用3D打印技術制造的新產品具 備環保、機械性能良好、安全性等多重優點，被廣泛應用于汽車、一次性用品、電子、醫療等 領域。更加值得關注的是極高光學純D-乳酸和k乳酸加工聚合而成的高品質聚乳酸(PLA) 與同樣生物可降解的下二酸下二醇醋-己二酸下二醇醋共聚物(PBSA)混紡可W大幅提高生 物可降解材料的強度和初性，拓展相關產品的應用領域。目前己斯夫等公司已經完成了PLA 與PBSA混紡產品的試制，并成功推出了一系列性能優良的新型生物可降解材料，相關進展 大幅度增加了極高光學純D-乳酸和k乳酸的市場需求。
[0004] 米根霉，嗜熱乳桿菌等傳統乳酸生產菌株由于其自身特性和所需培養基復雜等特 點導致所產乳酸光學純度無法滿足聚合級的要求而不能用于極高光學純D-乳酸和k乳酸 的規模化生產。重組酵母和重組大腸桿菌具備極高光學純D-乳酸和k乳酸合成能力，且具 備營養要求低，易于高密度培養，工業化規模推廣容易的優點，成為極高光學純D-乳酸和k 乳酸生產菌株的研究熱點。與重組酵母，經過多重遺傳修飾過的大腸桿菌，能夠合成極高光 學純度和極高化學純度的乳酸，并且由于大腸桿菌培養溫度顯著高于酵母，重組大腸桿菌 用于乳酸發酵生產的周期較重組酵母大為縮短。因此，重組大腸桿菌被認為是工業化規模 下生產極高光學純度D-乳酸和k乳酸最理想的菌株。
[0005] 特別是近年來，大腸桿菌作為D-乳酸生產菌種得到廣泛的認可。當大腸桿菌同樣 可W用于高光學純度心乳酸的發酵生產時，對于D-乳酸和心乳酸在同一條生產線上的交替 生產意義重大。而且運也有助于高品質乳酸單體及聚乳酸制造業的快速發展。
[0006] 圍繞重組大腸桿菌作為生產菌株用于極高光學純D-乳酸的發酵生產已經進行了 多項成效顯著的研究（Zhou L.et al.,Current Microbiology,2011,62:981-989;Zhu Y.et al.,Applied Environmental Microbiology,2007,73:456-464;Zhou S.et al., Applied Environmental Microbiology ,2003,69:399-407;Zhu J.et al.,Applied Microbiology and Biotechnology ,2004,64:367-375;Zhu J.et al.,Metabolic Engineering,2005,7:104-115;Bunch P.K.et al.,Microbiology,1997,143:187-195)。 如，I)嚴格厭氧發酵提高產酸效率化i et al., Ap plied Microbiology and Biotechnology，2002，60 :101-106); 2)停止通風條件下的低攬拌限氧發酵提高產酸效率 (Zhou L.et al., Qirrent Microbiology,2011,62:981-989) ;3)維持微好氧發酵條件提高 產酸效率(Tian K et al. ,2012
[0007] African Journal of Biotechnology , 11 (21):4860-4867；Zhou L et al., Biotechnology letters 2012,34:1123 1130) ;4)采用適宜培養溫度菌體生長和亞適宜生 長溫度限制菌體生長提高發酵產酸效率（Niu D et al. ,Microbial Cell Factories 2014,13:78-88;Zhou L et al.,Metabolic Engineering,2012,14:560 568);5)通過菌體 生長和發酵產酸采用不同碳源的方式提高發酵產酸效率等（Zhu L et al. ,Applied Environmental Microbiology,2007,73:456-464).
[000引發明人前期獲得的授權專利（中國專利，專利號：ZL201210102731.8)則通過基因 轉錄水平上引入溫度調控元件，并配合發酵溫度調控策略大幅度提高了D-乳酸的合成效 率。本發明在此基礎上通過引入菌體生長定量控制調控機制，形成了菌體生長過程和D-乳 酸合成過程的雙開關機制，進一步提高了 D-乳酸合成效率。
【發明內容】
[0009] 本發明所要解決的技術問題在于提供了一種聚合級乳酸單體生產菌。
[0010] 本發明所要解決的另一技術問題在于提供了上述聚合級乳酸單體生產菌的構建 方法。
[0011] 本發明所要解決的另一技術問題在于提供了應用上述聚合級乳酸單體生產菌的 乳酸制造技術，具體來說，是結合菌種代謝生長及產酸過程的特性和工業化規模生產的特 點形成的低成本易實施的微生物法極高光學純乳酸單體高效制造技術。
[0012] 為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：
[0013] -種用于發酵生產極高光學純D-乳酸的聚合級乳酸單體生產菌，菌株保藏號為 CGMCC No. 11059(是實施例中菌株編號為B0013-090B的菌株）。
[0014] -種用于發酵生產極高光學純レ乳酸的聚合級乳酸單體生產菌，菌株保藏號為 CGMCC No. 11060(是實施例中菌株編號為B0013-101J的菌株）。
[0015] 上述用于發酵生產極高光學純D-乳酸的聚合級乳酸單體生產菌和用于發酵生產 極高光學純心乳酸的聚合級乳酸單體生產菌分別具備形成極高光學純度D-乳酸和極高光 學純度k乳酸的能力，光學純度可W高于99.9%，所述D-乳酸和心乳酸的光學純度特征均 可W滿足高品質聚乳酸聚合過程對乳酸單體光學純度的最高要求。
[0016] 上述用于發酵生產極高光學純D-乳酸的聚合級乳酸單體生產菌和用于發酵生產 極高光學純k乳酸的聚合級乳酸單體生產菌分別具備形成高化學純度D-乳酸和高化學純 度心乳酸的能力，化學純度可W高于99%，所述D-乳酸的和心乳酸的化學純度特征經過簡 單的后續處理甚至不處理可W滿足高品質聚乳酸聚合過程對乳酸單體化學純度的最高要 求。
[0017] 上述用于發酵生產極高光學純D-乳酸的聚合級乳酸單體生產菌和用于發酵生產 極高光學純心乳酸的聚合級乳酸單體生產菌的構建方法為：
[001引單個或多個基因被敲除進行菌株初步構建，運些基因包括:I化A，thiE，dld，ackA， pta，pps，pf IB，poxB，frdA，adhE，1 IdD ;單個或多個基因被表達，運些基因包括：4曰]1- cI*?857-pR-pL-ldhA, IdhBcoa, Idhica, Idhstrb ；
[0019] 使用了溫度誘導型基因轉錄方式來控制和調節細胞生長過程和乳酸形成過程，包 括:菌株初步構建后，菌株在25-50°C條件下分階段完成細胞發酵培養-誘導-產酸，細胞生 長過程在單一發酵因子調控下可W定量控制細胞的積累量，所述單一發酵因子是細胞中央 代謝途徑關鍵酶轉錄過程的調控因子、關鍵酶翻譯過程的調控因子、關鍵酶分泌過程的調 控因子或關鍵酶表達后催化過程調控因子。
[0020] 優選的，上述聚合級乳酸單體生產菌的構建方法，所述菌株積累量的定量控制可 W通過預先計算，在不同的發酵體系下添加一定量的單一發酵因子按照生產過程的實際需 求精確控制。
[0021] 優選的，上述聚合級乳酸單體生產菌的構建方法，菌株初步構建后菌株的生長過 程都與單一發酵因素的調控相關聯，所述單一發酵因素可W是碳源，如葡萄糖、甘油；也可 W是單元如酵母膏、蛋白腺、硫酸錠、憐酸氨錠;也可W是金屬離子，如鐵離子、儀離子、巧離 子、鋒離子、儘離子、鉆離子、銅離子、鋼離子、鐘離子;也可W是營養元素，如VBl、VB6、VB12、 生物素、鹽酸硫胺素、焦憐酸硫胺素，等等，特別是其中一種單一發酵因素可W定量的控制 細胞的積累過程，并保證細胞快速積累且具備高活性;可W W開關控制的方式啟動或關閉 乳酸的合成過程，并且運一過程可W通過預先定量添加對應的發酵因素完成上述調控過 程。
[0022] -種乳酸制造技術，具體方法為:應用上述聚合級乳酸單體生產菌，所述菌株的宿 主細胞生長過程在全合成的無機鹽培養基中快速進行，所述全合成的無機鹽培養基為含硫 胺素的培養基，所述宿主細胞在全合成培養基中快速生長，其中，化發酵體系下于8-lOh內 菌體量積累到細胞干重11.5g/L，通過定量補加單一發酵因子，細胞干重進行更高積累，宿 主細胞培養過程中不大量形成乳酸，即乳酸的痕量形成不影響細胞生長，宿主細胞在生長 完成后快速積累乳酸。
[0023] 優選的，上述乳酸制造技術，D-乳酸和k乳酸的積累過程通過更換相應聚合級乳 酸單體生產菌在同一套生產體系下切換式進行。
[0024] 上述全合成培養基中有機物的添加不影響上述細胞高密度培養的過程，但不添加 有機物更有利于上述細胞高密度培養過程的進行。
[0025] 優選的，上述乳酸制造技術，所述全合成的無機鹽培養基主體成分如下：
[00%]用于D-乳酸發酵生產的發酵培養基(g/L):憐酸氨二錠0-25,憐酸二氨鐘0-5,憐酸 氨二鋼0-25,氯化鋼〇-5，MgS〇4 0-0.5，FeS〇4 0-1 ,FeCb 0-1，CoCl2 0-1，CuCl2 0-1， Na2Mo〇4 0-1，出B03 0-l，MnCl2 0-1，巧樣酸0-25,硫胺素0-1，木糖0-50,甘油0-50,葡萄糖0-50,硫酸0-5,抑 6.0-7.5。
[0027] 用于k乳酸發酵生產的發酵培養基(g/L):憐酸氨二錠0-25,憐酸二氨鐘0-5,憐酸 氨二鋼0-25,氯化鋼〇-5，MgS〇4 0-0.5，FeS〇4 0-l，FeCl3 0-l，CoCl2 0-l，CuCl2 0-l，ZnCl2 〇-l，Na2Mo〇4 0-1，出B03 0-l，MnCl2 0-1，巧樣酸0-化，硫胺素0-1，木糖0-50,甘油0-50,葡萄 糖0-50,硫酸0-5,抑 6.0-7.5。
[0028] 所述的發酵產酸過程具備可設定型的自動啟動特征，通過培養基組分和菌種自身 生長特性的組合，細胞生長至特定階段后由于培養基中對應調控因子組分的含量變化自動 啟動產酸過程。
[0029] 優選的，上述乳酸制造技術，所述菌株的生長過程W及乳酸形成過程都與發酵溫 度的過程相關聯，發酵產酸過程在非固定溫度下完成的，根據生產菌種產酸特性，其發酵溫 度的變化呈現梯度上升的趨勢，且存在一定組合方式下，溫度對產酸過程的影響最顯著，產 酸效率最高，如:發酵溫度升高生長會變緩慢，而發酵溫度降低生長會非常迅速，具備積累 高活性細胞的特點;發酵溫度升高乳酸會快速形成，而發酵溫度降低乳酸會緩慢形成，甚至 不形成，具備高效積累乳酸的特點。
[0030] 優選的，上述乳酸制造技術，所述菌株先在25-36°C下利用葡萄糖快速生長形成菌 體，然后在37-50°C下利用葡萄糖快速積累乳酸。
[0031] 由于菌株在較低的溫度下，如25-36°C，D-乳酸和k乳酸合成關鍵酶編碼基因1化A 和BcoaLDH的轉錄被強烈抑制；而在較高溫度下，如37-50°C，D-乳酸和k乳酸合成關鍵酶編 碼基因1化A和BcoaLDH的轉錄被強烈啟動，由此可見，菌株在生長的溫度和形成乳酸的溫度 可W是單一溫度下的持續過程，也可W是多個溫度點梯度式的組合過程。更優先使用多個 溫度點梯度式的組合過程。
[0032] 優選的，上述乳酸制造技術，具體步驟為：
[0033] (1)通過基因工程技術對D-乳酸和心乳酸高產重組菌染色體上的乳酸脫氨酶編碼 基因的表達進行簡易條件下的動態調控獲得產酸菌株；
[0034] (2)將菌株在25-36 °C、200r/min好氧生長6-1 Oh，再在37-45 °C靜置培養發酵乳酸， 并W出發菌種B0013-070作為對照菌種，分析細胞密度、糖耗、乳酸產率、代謝主要中間產物 及其它有機酸產物等，確定乳酸合成誘導時機；菌株分別在添加0.06-100yg/L硫胺素、 20化/min進行搖瓶培養；
[0035] (3)發酵生產極高光學純D-乳酸時，限氧階段0-化發酵溫度為33-39°C ,3-加發酵 溫度為37-42°(：，6-1化發酵溫度為38-451：，10-1611發酵溫度為40-481：，16-2地發酵溫度為 45-50 °C。
[0036] (3'）發酵生產極高光學純レ乳酸時，限氧階段發酵溫度為37-50°C，其余同步驟 (3)。
[0037] 優選的，上述乳酸制造技術，還包括發酵結束后乳酸的提取方法，結合生產菌種基 因工程改造后的特征，發酵液中D-乳酸和レ乳酸均W極高光學純度和化學純度的形式存 在，全合成培養基的使用保證了后提取過程的簡潔型，其最終產品的提取方式包括酸化，板 框去除菌體，超濾去除色素和雜蛋白，離子交換去除陰陽離子干擾，濃縮制備相應濃度的產 品，并納濾精制廣品等環節。
[0038] 優選的，上述乳酸制造技術，所述乳酸形成過程結束后通過低溫酸化的方式將D-乳酸和k乳酸游離出來，且上述乳酸游離的過程不受發酵液中其他殘余物的影響，酸化使 用的酸可W是硫酸，也可W是鹽酸或草酸，更優選使用硫酸。
[0039] 上述乳酸制造技術，所發酵生產的極高光學純D-乳酸和レ乳酸過程耗時不多于 30-36h，產D-乳酸和k乳酸水平分別達到150g/L和180g/L或W上，D-乳酸和k乳酸光學純 度均在99.95W上，化學純度均在97% W上。
[0040] 上述乳酸制造技術，還包括具有類似反應過程的其他化學品，如巧樣酸、甲酸、乙 酸、丙酬酸、下二酸、蘋果酸、a-酬戊二酸、下二酸、己二酸、戊二胺、己二胺、甲基丙締酸、異 戊二締、衣康酸等多種有機酸和有機胺;或脯氨酸、丙氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、精氨酸 等多種氨基酸;硫胺素、維生素 Bi2等多種微生物;或乙醇、丙醇等短鏈醇;或低聚異麥芽糖、 低聚果糖、低聚半乳糖等多種功能糖等等。
[0041] 本發明的有益效果是：
[0042] 本申請在化201210102731.8所述通過基因轉錄水平上引入溫度調控元件，并配合 發酵溫度調控策略大幅度提高了 D-乳酸的合成效率的基礎上，通過引入菌體生長定量控制 調控機制，形成了菌體生長過程和D-乳酸合成過程的雙開關機制，進一步提高了D-乳酸合 成效率;本發明中所述極高光學純k乳酸產生菌充分利用了外源心乳酸脫氨酶翻譯表達后 的酶學特性，并引入了其催化活性的溫度調控機制，配合菌體生長定量控制的調控機制，完 成了菌體生長和心乳酸合成的雙開關控制。
[0043] 更為突出的是，本發明中所述極高光學純D-乳酸生產過程和極高光學純k乳酸生 產過程可W通過菌種的簡單切換在同一生產體系下完成兩個產品的規模化生產。
[0044] 具體有益效果如下：
[0045] 1、本發明提供的重組菌具有明顯的高效合成極高光學純D-乳酸和k乳酸的能力， 同時上述重組菌具備的合成高化學純度D-乳酸和k乳酸的能力。菌種在25-5(TC的條件下 細胞快速生長8-1 Oh，發酵產酸16-1化，產D-乳酸水平達到15% (w/v)或W上，產心乳酸水平 達到18% (w/v)或W上；
[0046] 2、本發明的高效合成極高光學純乳酸單體基因工程菌，在菌體培養過程中，采用 全合成培養基，培養液澄清，有利于后續產品分離提取；
[0047] 3、本發明的高效合成極高光學純乳酸單體基因工程菌，在菌體生長和發酵產酸過 程可W通過溫度變化有效控制；
[0048] 4、本發明的高效合成極高光學純乳酸單體基因工程菌，在菌體生長和發酵產酸過 程可W通過營養元素的添加定量控制和開關控制
[0049] 5、本發明的極高光學純乳酸單體高效制造過程:菌體細胞生長溫度在25-36°C下 利用葡萄糖快速生長6-12h，形成菌體;在37-5(TC下利用葡萄糖快速合成極高光學純D-乳 酸和k乳酸。即：運用本發明的重組菌及其極高光學純乳酸單體制備工藝，生產過程僅需改 變發酵溫度控制參數并配合營養元素的添加，即可實現極高光學純D-乳酸和k乳酸的高效 制備過程。
【附圖說明】
[0050] 圖1突變盒質粒pUC-1化Ap: :kan-clt巧57-郵-PL的物理圖譜；
[0051 ]圖2突變盒質粒pUC-thiE' ： ：difGm的物理圖譜；
[0化2]圖3突變盒質粒pUC-dld' ： ：difGm的物理圖譜；
[0化3] 圖4突變盒質粒pUC-ackA-p化' ：：difGm的物理圖譜；
[0054] 圖5突變盒質粒pUC-pps' ： ：difGm的物理圖譜；
[0055] 圖6突變盒質粒pSK-pflB' ： ：difGm的物理圖譜；
[0化6] 圖7突變盒質粒pUC-poxB' ： ：difGm的物理圖譜；
[0057] 圖8突變盒質粒pSKsym-frdA' ： ：difGm的物理圖譜；
[0化引圖9突變盒質粒pUC-a化E' ： ：difGm的物理圖譜；
[0059] 圖10突變盒質粒pUC-1化A: :difGm的物理圖譜；
[0060] 圖11突變盒質粒pUC-11郵' ：=PidhA-I化Bcoa-difGm的物理圖譜；
[0061 ] 圖12突變盒質粒pUC-11郵' ：=PidhA-I化Lca-difGm的