膠球藻屬的新的抗輻射藻類的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及新的藻類，及其從水性環境中，尤其是從放射性環境中捕獲金屬的應 用。
【背景技術】
[0002] 放射性流出物主要由核電站產生。它們主要是來自乏燃料池的水、來自凈化罐的 水、來自核廠冷卻系統的水或被排放到環境中的最終流出物，運些水或最終流出物由于不 活潑化合物被福射激活或由于放射性化合物的釋放和溶解，而最終含有放射性化合物。放 射性流出物的其它來源包括核醫學、提供放射化療的醫院和使用放射性材料的研究實驗 室。本發明還設及來自某些非核產業(例如稀±開采)的流出物。
[0003] 含有放射性化合物的流出物(尤其是水)可通過多種物理和化學方法進行純化。但 是，運些方法的運行和設備的成本高，需要重型維護，并且生成大量的放射性廢物。此外，運 些方法的應用領域常常是有限的。例如，使用離子交換樹脂，W在核廠的水中維持低導電 性。運些離子交換樹脂變得負載有放射性離子，并且當飽和時，被儲存起來W等待適當的再 處理加工，或被儲存在利用有毒或高反應性化合物的條件下。
[0004] 進一步地，一些現存的生物學方法使用例如細菌、真菌、酵母或植物，來純化受(放 射性或非放射性)有毒產物污染的介質(工業流出物、天然介質等）。運些方法使用活的有機 體，（通過改變化學形態)來濃縮、同化或降低污染化合物的毒性，或使用無生命的生物質或 來自活的有機體的衍生物，對污染物進行生物吸收。
[0005] 生物學方法通常具有比物理和化學方法更寬的應用領域。它們不需要添加化學試 劑或產物，并且通常處理成本較低，因此具有經濟利益。
[0006] 植物尤其是±壤或水的良好的純化者，因為植物具有代謝物、蛋白、酶、輸入機制、 膜通道、內部結構等完整的系統，運使得它們根據具體情況能固定有毒化合物，在植物的外 部或內部與它們馨合，經由特異性或非特異性的輸入途徑W不同的量與它們結合，將它們 隔離在細胞內，改變它們的形態，從而使它們無害或毒性較小，使它們的可溶性變低，將它 們W非毒性的形式儲存在液泡中等。
[0007] 研究已經示出，某些微生物能經由生物吸附濃縮在稀溶液中的金屬離子，諸如Ag、 Al、Au、Co、Cd、Cu、Cr、Fe、Hg、Mn、Ni、饑、Pd、Pt、U、Th、Zn等（Whiteetal.,Inte;rnational 81〇(1616'1〇阿^〇11&81〇(16邑拘(1日11〇11，35:17-40，1995;1].5.化1.齡.6,355，172)。生物吸附 (biosorption)是生物質利用無代謝活性的物理化學機制，經由與位于細胞表面上的壁化 合物的官能團相互作用，結合重金屬的能力。例如，已經公開微生物的混合物W及細菌可用 于對重金屬進行非選擇性生物吸收(biosorb) (U. S.化t. No . 7，479，220 ; PCT申請WO 03/ 011487)。
[000引其它方法使用死亡的生物質或來源于活的有機體培養物的衍生化合物，來凈化金 屬污染的介質。所采用的方法包括無生物活性的物理化學機制，諸如例如與在細胞壁中存 在的多糖的離子交換，絡合作用或吸附。
[0009] 已經使用來源于藻類的生物質，例如來源于藻類細胞壁的生物質，來純化在廢液 中包含的金屬化.5.口曰1.齡.4,769,223;口(：1'申請胖0 86/07：346;1].5.化1.齡.5,648,313;口押 申請WO 2006/081932)。
[0010] 對于處理被放射性化合物污染的介質，很少有方法使用活的有機體。實際上，在水 被放射性化合物污染或靠近放射性源的情況中，必須使用能經受污染物的化學和放射學毒 性并且能W足W在工業凈化工藝背景中使用的量與運些污染物結合的耐福射或抗福射的 有機體。
[0011] 還沒有對核流出物中的放射性核素進行生物凈化方法。但是，在2011年3月11日發 生的福島核事故使日本考慮使用運種類型的解決方案，其中使用了由脫水微藻擬小球藻屬 (Parachlorella sp.Binos)構成的材料(WO 2010/024367)。5克脫水微藻可凈化1升組成與 福島反應器的水類似的水。美國一直對利用生物學方法來純化放射性核素的可行性感興 趣。已經考慮了念珠新月藻(Closterium moniliferum)(-種結合鎖的藻類）的應用，但是 還沒有測試過運種藻類積累放射性同位素或抗福射的能力（Krejci M.R.et al.， ChemSusChem,4:470-473，2011;Lovett R.A.,Nature，doi:10.1038/news.2011.195， 2011)。
[0012] 在天然環境中，積累放射性化合物的有機體通常經受低放射性。例如，在切爾諾貝 利事故剛發生之后，對于水環境，反應器冷卻罐中的水的內部電離福射的劑量率不超過100 JiGyA，而且1986年的年最大累積劑量是0.0 IGy。而位于發電廠附近30km的區域內，來源于 沉積在普里皮亞季河(Pripyat River)沉積物上的放射性核素的劑量率，在事故之后立即 增加數倍，達到〇.4mGy/h(Kryshev and Sazykina,Journal of Environmental Radioactivity,28:91-103,1995)〇
[0013] 在大多數情況中，針對用于消除放射性污染的材料或流出物的污染和/或用于濃 縮放射性化合物所提出的微生物對電離福射的抗性還沒有被測試。實際上，微生物用于提 取軸化)和社仰），而軸(U)和社仙）的主要同位素的活性低(例如，含lOiig/1的 238曬P5U的 溶液的活性分別是0.13Bq/l或0.8Bq/l)。11. S.Pat .No. 4，320，093公開了根霉菌(I?hizopus) 屬的真菌用于提取包含在水性流出物中的軸或社的應用。專利GB 1,472,626公開了對預習 慣于軸的單細胞綠藻進行X射線福照而獲得的單細胞綠藻突變體的應用。另外，專利 GBl 507003公開了多種微生物，尤其是黑曲霉（Aspergi Ilus niger)和藍顫藻 (Oscillatoria cyanobacteria )的真菌，用于濃縮海水中天然存在的軸的應用。 U. S.化t .No . 7,172,691公開了小球藻屬（化loreIla)、柵藻屬（Scenedesmus)、卵囊藻屬 (Oocyst is)和衣藻屬(Chlamydomonas)的活的光合藻類，用于濃縮來自水性介質的放射性 污染物，尤其是軸的應用，該水性介質含軸濃度為約0~20ppm，運代表 238U和235U的活性分別 為260Bq/l和ISOOBq^。相比之下，來自核乏燃料池的水的活性約為300,000Bq/l，該來自核 乏燃料池的水構成本發明的微藻的生存環境。
[0014] 迄今為止，所公開的抗福射最強的有機體是原核生物。抗福射奇異球菌 (Deinococcus radiodurans)種具有神奇的抗電離福射的能力，能在60Gy/hd福照下生長， 并且能在ISkGy的劑量下存活下來。
[0015] 但是，在福射耐受性與放射性核素或金屬的顯著積累之間沒有聯系。使用抗福射 細菌Deinococcus radiodurans作為放射性介質的凈化者，需要對細菌進行遺傳改造，W引 入使其能積累感興趣的金屬的基因。例如，已經提出，為了在核廢物點進行原位生物修復， 而使用經遺傳改造的異常球菌(Deinococcus)屬的細菌，來表達能對有機化合物、金屬或放 射性核素進行解毒或代謝的酶(PCT申請WO 01/23526)。最近，從高活性的放射性廢物點，分 離并且純化出了耐福射動球菌化ineococcus radiotolerans)種的細菌。運些細菌被描述 為，能在大于IOGyA劑量率的離子福射的存在下降解有機污染物，并且利用已經提出但還 沒有被證實的生物吸附，非選擇性消除放射性核素的污染化.S.Pat.No. 7，160，715)。
[0016]運兩種有機體具有是非自養型細菌的缺點，因此需要外部供應碳營養物，才能利 用它們的培養物。此外，與需要養分較少、細菌污染物敏感性較小的培養基的自養型有機體 相比，非自養型細菌培養物對污染物更敏感。
[0017]已公開了兩種耐福射的、自養型有機體。已經研究了耐受電離福射仙5〇為6kGy)的 綠藻（化Iorophyceae)綱的微藻（Farhi E.et al. ,J.F*hys.Condens.Matt. ,20:104216, 2008)。另外，還鑒定出新的微藻物種Coccomyxa actinabiotis，它耐受電離福射，LD日0為 10kGy(PCT申請WO 2011/098979)。運樣的福射耐受水平是罕見的，尤其在藻類中是罕見的。 通常來講，藻類抗電離福射的LD日日值在30Gy至1200Gy之間（International AtomiC Energy Agency, IAEA, ''Effects of ionizing radiation on aquatic organisms and ecosystems,"Technical Reports Series No.172,1976)。
[0018] 在PCT申請WO 2011/098979中描述的藻類Coccomyxa actinabiotis能攝取并且濃 縮水性介質的溶液中的放射性或非放射性金屬離子，并且能在放射性介質中生長。
[0019] 例如，含有該藻類的實際尺寸的池的純化測試W同等效果生成一定體積的廢物， 該廢物的體積約為在純化核廠的水的傳統方法中使用的離子交換樹脂的1/100。
【發明內容】
[0020] 發明人現在發現，膠球藻(Coccomyxa)屬的其它微藻能攝取并且濃縮水性介質的 溶液中的放射性離子，并且還能在放射性介質中生長。
[0021] 發明人尤其發現，在核乏燃料池中，新的Coccomyxa物種在運種富有電離福射但營 養物非常貧乏的環境中自發生長。
[0022] 發明人分離且表征了該新的物種，并在下文中將該新的物種稱為Coccomyxa C-IR3-4C。和Coccomyxa actinabiotis-樣，該藻類即耐福射，而且還是放射性核素的積累 者。根據布達佩斯條約，該微藻于2013年1月29日保藏在藻類和原生動物培養物保藏機構 (Qilture Collection of Algae and Protozoa,CCAP，英國，海洋科學蘇格拉協會，鄧斯代 夫納奇海洋實驗室（Dunstaffnage Marine LaboratoiT) ,GB-Oban,阿蓋爾郡（Argyll), PA371QA)，編號為CCAP 216/26。
[0023] Coccomyxa C-IR3-4巧巾的藻類的特征尤其在于，它們的對應于18S核糖體RNA-ITS1-5.8S核糖體RNA-ITS2-28S核糖體RNA(起始）的基因包括:與SEQ ID N0:1的序列具有 至少96%同一性的序列，并且W遞增的優先次序，包括與SEQ ID NO: 1的序列具有至少 97%、98%或99%同一性的序列。
[0024] 在對齊序列之后，使用BLAST黎工具，在由SEQ ID NO: 1的整條序列組成的比對窗 口上，計算上述同一性的百分比。
[00巧]Coccomyxa C-IR3-4巧巾的藻類還可表征為，對應于ITS1-5.8S rRNA-ITS2的區域 與SEQ ID NO: I的序列的對應區域具有至少96%的同一性。基于發明人的觀察，將運一闊值 估計為96%，其中發明人示出該區域在Coccomyxa C-IR3-4C和其它Coccomyxae之間具有最 大95%的同一性，而其它Coccomyxae的ITS1-5.8S rRNA-ITS2彼此之間具有最大88%的同 一性。
[00%] Co