通過施用pcsk9抑制劑抑制動脈粥樣硬化的方法
【專利說明】通過施用PCSK9抑制劑抑制動脈粥樣硬化的方法
[0001] 相關專利申請
[0002] 本申請要求獲得如下申請的利益:2013年6月7日提交的美國臨時專利申請No .61/ 832，459,2013年6月7日提交的歐洲專利申請No. 13305762.0,2013年10月17日提交的美國 臨時專利申請No.61/892,215,2013年10月18日提交的歐洲專利申請No. 13306436.0,2014 年2月26日提交的美國臨時專利申請No. 61/944，855，和2014年5月23日提交的美國臨時專 利申請No. 62/002，508。本文引入前述每一個專利申請的全部內容。 發明領域
[0003] 本發明設及動脈粥樣硬化治療領域。更具體地，本發明設及施用前蛋白轉化酶枯 草桿菌蛋白酶Aexin 9型(PCSK9)抑制劑來抑制受試者體內動脈粥樣硬化斑塊的形成。
[0004] 背景
[0005] 動脈粥樣硬化是在西方世界導致死亡和屯、血管發病率的主要原因。動脈粥樣硬化 的風險因素包括低密度脂蛋白化DL)膽固醇水平高、高密度脂蛋白化DU膽固醇水平低、高 血壓、糖尿病、家族病史、男性、吸煙和高血清膽固醇。
[0006] 前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶kexin型9 (PCSK9)是屬于分泌型枯草桿菌酶家族蛋 白酶K亞家族的前蛋白轉化酶。它是一種參與LDL代謝的絲氨酸蛋白酶，主要在肝、腎和腸中 表達。有證據表明，PCSK9通過促進LDL受體降解來增加血漿LDL膽固醇，其中LDL受體介導肝 臟中LDL胞吞，運是從循環清除LDL的主要途徑。
[0007] 使用PCSK9抑制劑(抗-PCSK9抗體)降低血清總膽固醇、U)L膽固醇和血清甘油S醋 已經在美國專利No. 8，062，640，8，357，371和美國專利申請公開號2013/0064834中被描述。 然而，尚未有報道PCSK9抑制劑用于減少或抑制受試者體內動脈粥樣硬化斑塊形成的進展。 本領域中對抑制動脈粥樣硬化斑塊形成的治療方法仍然有需求。 發明概要
[000引本發明致力于通過提供用于抑制受試者體內動脈粥樣硬化斑塊形成的方法和組 合物來滿足本領域對治療方法的需要。在某些方面中，本發明的方法和組合物一般包括選 擇患有動脈粥樣硬化、或者具有發生動脈粥樣硬化風險的患者，和向該受試者施用包含前 蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶Aexing型(PCSK9)抑制劑（例如，抗-PCSK9抗體或抗原結合蛋 白）的藥物組合物。在其他方面中，本發明提供了包含PCSK9抑制劑的藥物組合物，其適用于 抑制受試者體內的動脈粥樣硬化斑塊形成。在其他方面中，本發明提供了通過向受試者施 用包含PCSK9抑制劑的藥物組合物抑制受試者體內動脈粥樣硬化斑塊形成的方法。
[0009] 在某些實施方案中，受試者是非高脂血的。在其他實施方案中，受試者表面上是健 康的。
[0010] 在另一個方面中，本發明提供了治療或抑制受試者體內動脈粥樣硬化進展的方 法，該方法包括：（1)選擇已遭受中風或屯、肌梗死的受試者;和(b)向受試者施用包含PCSK9 抑制劑的藥物組合物，借此治療動脈粥樣硬化或抑制動脈粥樣硬化的進展。在一個實施方 案中，受試者是非高脂血的。
[0011] 在另一個方面中，本發明提供了包含PCSK9抑制劑的藥物組合物，適用于治療或抑 制已遭受中風或屯、肌梗死的受試者體內的動脈粥樣硬化的進展。
[0012] 在另一個方面中，本發明提供了治療或抑制非高脂血癥受試者體內動脈粥樣硬化 進展的方法，該方法包括：（a)選擇患有動脈粥樣硬化或者已知具有發生動脈粥樣硬化的風 險的受試者，其中該受試者是非高脂血的；和(b)向受試者施用包含PCSK9抑制劑的藥物組 合物，借此治療動脈粥樣硬化或抑制動脈粥樣硬化的進展。在一個實施方案中，受試者表面 上是健康的。在另一個實施方案中，受試者是非高膽固醇血的。在另一個實施方案中，受試 者是非高甘油S醋血的。
[0013] 在另一個方面中，本發明提供了包含PCSK9抑制劑的藥物組合物，適用于治療或抑 制非高脂血癥受試者體內動脈粥樣硬化的進展，其中該受試者患有或者具有發生動脈粥樣 硬化的風險。
[0014] 在某些實施方案中，受試者患有選自下組的疾病或病癥：1型糖尿病、2型糖尿病、 川崎病、慢性炎癥性疾病、和高血壓。在另一個實施方案中，受試者具有升高水平的炎癥標 志物。在進一步的實施方案中，炎癥標志物是C反應蛋白。在更進一步的實施方案中，炎癥標 志物是炎性細胞因子。
[0015] 在某些實施方案中，PCSK9抑制劑是特異結合PCSK9的抗體或抗原結合蛋白。在其 他實施方案中，抗體包含具有SEQ ID ^:12，13，14，16，17，和18的重鏈和輕鏈〔03氨基酸序 列。在某些實施方案中，抗體或抗原結合蛋白包括具有SEQ ID NO: 11氨基酸序列的HCVR和 具有SEQ ID NO: 15氨基酸序列的LCVR。在某些實施方案中，抗體或抗原結合蛋白包括具有 SEQ ID NO:2，3,4,7,8,和10的重鏈和輕鏈CDR氨基酸序列。在某些實施方案中，抗體或抗原 結合蛋白包括具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO:6氨基酸序列的LCVR。 在一個實施方案中，抗體或抗原結合蛋白與包含分別在SEQ ID NO: 1和6;或11和15中示出 的重鏈和輕鏈可變域氨基酸序列的抗體結合PCSK9上相同的表位。在一些實施方案中，抗體 或抗原結合蛋白與包含分別在SEQ ID NO: 1和6;或11和15中示出的重鏈和輕鏈可變域氨基 酸序列的抗體競爭與PCSK9的結合。
[0016] 在另一個實施方案中，PCSK9抑制劑可W將受試者體內動脈粥樣硬化斑塊形成減 少至少 10% ,20% ,30% ,40% ,50% ,60% ,70% ,80%，或90%。
[0017] 在一些實施方案中，受試者患有雜合子家族性高膽固醇血癥化eFH)。在另一個實 施方案中，受試者具有高膽固醇血癥的非家族性高膽固醇血癥(nonFH)的形式。
[0018] 在某些實施方案中，受試者在施用抗體或抗原結合蛋白之前和/或期間使用另一 種脂質調節劑。治療性脂質調節劑包括他汀類、膽固醇攝取抑制劑、依澤替米貝、貝特類、煙 酸、《 -3脂肪酸、和膽汁酸樹脂。他汀包括西立伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、瑞 舒伐他汀、氣伐他汀、洛伐他汀和普伐他汀。
[0019] 在一些實施方案中，抗體或抗原結合蛋白是皮下給藥的。
[0020] 本發明還提供了包含PCSK9抑制劑藥物組合物的單位劑型。在某些實施方案中， PCSK9抑制劑是抗體或抗原結合片段，并且該單位劑型包括75mg，150mg，200mg，或300mg抗 體或抗原結合片段。單位劑型可W是預裝填注射器、預裝填自動注射器、小瓶、藥筒 (cartridge)、可重復使用的注射器，或可重復使用的自動注射器;單位劑型可W被氣密密 封，并且可W進一步指示劑量。
[0021] 本發明還提供了制品或試劑盒，其包含PCSK9抑制劑藥物組合物和容器，在一些實 施方案中，還包括使用說明書。
[0022] 本發明還提供了使用包含PCSK9抑制劑的組合物在制造用于(3)、化)或山）的藥物 中的用途：（a)抑制受試者體內動脈粥樣硬化斑塊的形成；（b)治療或抑制已遭受中風或屯、 肌梗死的受試者體內動脈粥樣硬化的進展；（C)治療或抑制非高脂血受試者體內的動脈粥 樣硬化的進展，其中該受試者患有動脈粥樣硬化或者已知具有發生動脈粥樣硬化的風險。
[0023] 附圖簡述
[0024] 圖IA-D顯示的一系列圖表描述了 mAb316P、阿托伐他汀、及其組合在18周治療期之 后對多種參數的影響。圖IA顯示了對平均血漿總膽固醇的影響；圖IB顯示了對甘油=醋水 平的影響。圖IC和ID顯示了 12周治療后通過FPLC脂蛋白分離評估的脂蛋白膽固醇概貌，W 研究單獨的mAb316P(圖1C)和mAb316P與阿托伐他汀的組合（圖1D)的影響。與對照相比**沖 <0.0045 ;與阿托伐他汀相H
3mg/kg mAb316P與 10mg/kgmAb316P相比，
:每組n = 15)。
[0025] 圖2A顯示了 mAb316P、阿托伐他汀、及其組合對肝臟低密度脂蛋白受體蛋白水平的 影響。與對照相比，**沖<0.0045;與阿托伐他汀相比
3mg/kg mAb316P與 lOmg/kg mAb316P相比
每組n = 15)。圖 2B顯示了 mAb316P、阿托伐他汀、及其組合對非化D-膽固醇水平的影響。與對照相比，**沖<0.0 Ol;與 阿托伐他汀相比
，
[0026] 圖3A-F的一系列照片描述了 mAb316P、阿托伐他汀、及其組合對斑塊形貌的影響。 分別是對照（圖3A)、3mg/kg mAb316P(圖3B)、10mg/kg mAb316P(圖3C)、阿托伐他汀（圖3D)、 3mg/kg mAb316P+阿托伐他汀（圖3E)和lOmg/kg mAb316P+阿托伐他汀（圖3F)治療18周后主 動脈根部區域截面的蘇木精-焰紅染料-藏紅花染色的動脈粥樣硬化病變的代表性圖像。
[0027] 圖4A-D所示的一系列圖片描述了 mAb316P、阿托伐他汀、及其組合對主動脈根部和 主動脈弓中的粥樣硬化發生的影響。在治療18周后，對每個截面的總病變面積（圖4A)和病 變數目（圖4B)進行評估。對病變嚴重程度進行評估，并分類為無病變、輕度型）和重 度（IV-V型）病變（圖4C)。在油紅0染色后評估主動脈弓的總斑塊負荷（圖4D)。數據表示為被 染色的面積的百分比。與對照相比，沖<0.05 ;**沖<0.0045;與阿托伐他汀相比：
mAb316P 與 lOmg/kg mAb316P 相 tt， 恨部區中每組n = 15,弓中n = 6-7)。
[0028] 圖5顯示了平均血漿總膽固醇與動脈粥樣硬化病變面積之間的相關性。病變面積 的平方根對平均總膽固醇作圖。實施了線性回歸分析。
[0029] 圖6的一系列照片描述了 mAb316P、阿托伐他汀、及其組合對病變組成的影響。代表 性圖片顯示了對照、單獨用mAb316P、和mAb316P與阿托伐他汀組合處理18周后，用Mac-3對 巨隧細胞進行免疫染色，隨后用天狼星紅對膠原染色、用a肌動蛋白對平滑肌細胞(SMC)染 色的結果。
[0030] 圖7A-C的一系列圖片描繪了 mAb316P、阿托伐他汀、及其組合對病變組成的影響。 在對病變大小進行校正后，確定重度（IV-V型）病變中作為去穩定化因子的巨隧細胞含量 (圖7A左圖）和壞死含量（圖7A右圖），包括膽固醇裂隙，和作為穩定因子的SMC含量（圖7B左 圖）和膠原含量（圖7B右圖）。與對照相比，沖<0.05，*沖<0.01，**沖<0.0 O1;與阿托伐他汀相 比，#P<0.05，##P<0.Ol，##胖<0.0 Ol。計算穩定因子與去穩定因子的比值作為斑塊穩定性指 數（圖7 C )。與對照相比，* P < 0 . 0 5 ; * * * P < 0 . 0 0 4 5 ;與阿托伐他汀相比，
;3mg/kg mAb316P與lOmg/kg mAb316P相比每組n = 15)。
[0031 ]圖8A-C的一系列圖片描述了mAb316P、阿托伐他汀、及其組合對血管炎癥標志物的 影響。確定每個截面中附著到內皮上的單核細胞數目（圖8A)和主動脈根部區域的T細胞數 目（圖8B)。此外，確定被染色面積的百分比（圖8C)作為細胞內粘附分子I(ICAM-I)。納入了 代表性的圖片。與對照相比，沖<0.05，*沖<0 . Ol，**沖<0.0045 ;與阿托伐他汀相比，
每組n = 15)。
[0032] 詳細說明
[0033] 在描述本發明之前應當理解，本發明不僅限于運里描述的特定方法和實驗條件， 因為運些方法和條件是可W變化的。還應當理解，本文所用術語僅是出于描述特定實施方 案的目的，并不意圖具有限制，因為本發明的范圍僅由附加權利要求限定。
[0034] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通 技術人員所公知的相同的含義。如本文所使用的，術語"約"在用于指示某個特定列舉的數 值時，意味著該數值可W從所引數值偏差不超過1%。例如，如本文所使用的，表述"約100" 包括99和101W及之間的所有數值(例如，99.1，99.2，99.3，99.4等）。
[0035] 下面描述了示例方法和材料，但在實施本發明時可W使用任何與本文所述相似或 等價的方法和材料。本文引入在運里提到的所有出版物和與本文同時提交的序列表的全部 內容。
[0036] 用于抑制動脈粥樣硬化的方法
[0037] 本發明的方法包括選擇患有動脈粥樣硬化或者具有發生動脈粥樣硬化風險的受 試者，和向運些受試者施用包含PCSK9抑制劑的藥物組合物。
[0038] 動脈粥樣硬化的風險因素是本領域眾所周知的，并且包括，但不僅限于，低密度脂 蛋白化化)膽固醇高、高密度脂蛋白化DL)膽固醇水平低、高血壓、糖尿病、家族史、男性、吸 煙、和高血清膽固醇。為給定的受試者評估運些風險因素的方法也是本領域眾所周知的。
[0039] 在某些實施方案中，所選擇受試者是非高脂血的。"非高脂血的"受試者是非高膽 固醇血和/或非高甘油=醋血的受試者。"非高膽固醇血"的受試者是不符合當前對于高膽 固醇血癥受試者的確立標準的人（見例如化rrison's Principles of Experimental Medicine,第 13版，McGraw-Hill, Inc.，N.Y)。高膽固醇血癥受試者的 LDL 水平〉160mgAlL，或 者〉130mg/dL并且具有至少2個選自下組的風險因素：男性、早發冠屯、病家族史、吸煙(每天 超過10支）、高血壓、低皿L(<35mgAlL)、糖尿病、高膜島素血癥、腹部肥胖、高脂蛋白（a)、和 腦血管疾病或閉塞性外周血管疾病的個人史。高甘油=醋血癥受試者的甘油=醋(TG)水平 〉250mg/dL。因此，非高脂血受試者的定義為膽固醇和甘油S醋水平低于上面為高膽固醇血 癥和高甘油=醋血癥受試者設定的極限。在某些實施方案中，所選受試者既不是非高脂血 的也沒有接受過高脂血癥治療。
[0040] 在某些實施方案中，所選受試者表面上是健康的。如本文所使用的，"表面上是健 康的"意思是個體先前沒有發生急性不良屯、血管事件，例如屯、肌梗死（即個體不具有由于原 發性不良屯、血管事件所致的升高的繼發性不良屯、血管事件的風險）。表面上健康的個體也 沒有顯示疾病癥狀。
[0041] 在某些實施方案中，選定的受試者先前曾罹患急性屯、血管不良事件，例如屯、肌梗 死、中風、屯、絞痛和/或外圍動脈血管疾病。在一個實施方案中，所選受試者先前曾罹患急性 屯、血管不良事件，例如屯、肌梗死、中風、屯、絞痛和/或外圍動脈血管疾病，但是是非高脂血 的。在一個實施方案中，選定的受試者先前曾遭受急性屯、血管不良事件，例如屯、肌梗死、中 風、屯、絞痛和/或外圍動脈血管疾病，但既不是非高脂血的，也不在接受高脂血癥治療。
[0042] 在某些實施方案中，選定的受試者患有選自下組的疾病或病癥：1型糖尿病、2型糖 尿病、川崎病、慢性炎癥性疾病、和高血壓。在一個實施方案中，所選受試者患有選自下組的 疾病或病癥：1型糖尿病、2型糖尿病、川崎病、慢性炎癥性疾病、和高血壓，但是是非高脂血 的。在一個實施方案中，選定的受試者患有選自下組的疾病或病癥：1型糖尿病、2型糖尿病、 川崎病、慢性炎癥性疾病、和高血壓，但既不是非高脂血的，也不在接受高脂血癥治療。
[0043] 在某些實施方案中，選定的受試者具有升高水平的炎癥標志物。在一個實施方案 中，選定的受試者具有升高水平的炎癥標志物，但是是非高脂血的。為了本發明的目的可W 使用系