濃縮von Willebrand因子或其絡合物的新方法
【專利說明】濃縮von Wi I Iebrand因子或其絡合物的新方法 發明領域
[0001 ] 本發明設及一種用于從水溶液濃縮von Willebrand因子(VWF)的方法，其包括通 過提供巧離子和憐酸鹽離子來沉淀VWF，并且隨后借助包含巧絡合化合物的水溶液來重新 溶解VWF。
[0002] 發明背景
[0003] 最流行的出血病之一是von Willebrand氏病(VWD)，其是由缺少von Willebrand 因子(VWF)、降低的VWF水平或具有功能缺陷的VWF變體的表達引起的。
[0004] VWF是已知的最大血漿蛋白之一。VWF是存在于哺乳動物血漿中的多聚粘性糖蛋 白，其具有多個生理功能。在初步的止血過程中，VWF作為血小板表面上的特定受體與胞外 基質的組分(如膠原)之間的介質。此外，VWF作為促凝血因子VIII的載體和穩定蛋白。VWF在 內皮細胞和巨核細胞中作為2813個氨基酸前體分子合成。野生型VWF的氨基酸序列和CDNA 序列公開于 Collins 等，1987 ,Proc 化 tl. Acad. Sci. USA84:4393-4397。前體多膚，前-原-VWF(pre-pro-VWF)，由成熟血漿VWF中發現的22個殘基信號膚、741個殘基原-膚和2050個殘 基多膚組成(Fischer等，陽BS Lett. 351:345-348，1994)。信號膚在內質網中切割后，在VWF 的兩個單體之間形成C-端二硫橋鍵。在通過分泌途徑進一步運送的過程中，添加了 12個N-連接的和10個0-連接的碳水化合物側鏈。更重要的是，VWF二聚體通過N-端二硫橋鍵多聚 化，并且通過后期高爾基體中的酶PACE/弗林蛋白酶切割掉741個氨基酸長的原膚。原膚W 及高分子量的VWF多聚體(VWF-HMWM)儲存在內皮細胞的We化el-Pallade體或血小板的a-粒 中。
[0005] 一旦分泌至血漿中，VWF的Al結構域內的蛋白酶ADAMTS13切割VWF。血漿VWF因此由 整個范圍的多聚體組成，所述范圍從500W)a的單個二聚體到由多達超過20個二聚體的分子 量超過10 ,OOOkDa組成的多聚體。VWF-HMWM由此具有最強的止血活性，其可W W利托菌素輔 因子活性(VWF: RCo)來測量。VWF: RCoAWF抗原的比例越高，高分子量多聚體的相對量越高。
[0006] VWF中的缺陷是VWD 0的誘因，其特征在于或多或少明顯的出血表型。3型VWD是最 嚴重的形式，其中VWF完全缺失，1型VWD設及一定量的VWF缺失并且其表型可能是非常輕度 的。2型VWD設及一定量的VWF缺失并且可能與3型VWD-樣嚴重。2型VWD具有許多亞型，其中 一些與高分子量多聚體的缺失或降低有關。2a型Von VWD的特征在于中間體和大的多聚體 兩者的缺失。2B型VWD的特征在于最高分子量的多聚體的缺失。
[0007] VWD是人類中最常見的遺傳性出血病，并且可W通過用含有血漿或重組來源的VWF 的濃縮物的替代療法來治療。例如，按照EP 0503991中所述的，可W從人血漿制得VWFdEP 0784632描述了一種用于分離重組VWF的方法。
[000引在血漿中，因子VIIIW高親和力與von VWF結合，運種結合使因子VIII免受早熟的 分解代謝，并且因此除了在初步止血中的作用，VWF還起到調節因子VIII的血漿水平的關鍵 作用，并且因此也是控制次級止血的中屯、因子。
[0009] 使用重組或血漿衍生的VWF或VWF/因子VIII絡合物來提供用于治療VWD的藥物制 劑，并且VWF/因子VIII絡合物也已經用于治療醫學適應癥血友病A，在該疾病中，因子VIII 缺失或只能W降低的濃度或作為具有降低的功能性的因子VIII變體獲得。
[0010] 為了提供運樣的藥物制劑，需要有效且可擴充的VWF純化方法。
[0011] 由于其巨大的尺寸，VWF多聚體對剪切力尤為敏感。在高于2000se(Ti的剪切力下， VWF多聚體已經開始解折疊，并且因此解折疊的VWF隨后易于降解和變性。在工業制造過程 中常用的濃縮治療蛋白的方法(如超濾)不適用于在工業規模制造中濃縮VWF，因為它們施 加了太高的剪切力。WO 2010/025278提供了一種使用中空纖維膜的技術方法來實現VWF的 濃縮，而沒有損害其比活性，但需要確定可替換的技術，W從包含VWF的溶液中濃縮VWF，所 述技術更簡單、更廉價且是可擴充的，同時保持運種絡合物大分子的結構完整性和生物活 性。
[0012] 蛋白沉淀是現有技術中已知的技術。然而，對于每種給定的蛋白，必須確定最佳的 沉淀劑和沉淀參數。怎樣才能實現沉淀的一種方式是通過鹽析程序（例如，通過使用硫酸 錠），其中用于沉淀的鹽的離子組分與祀蛋白競爭水分子，并且如果鹽離子的濃度足夠高， 祀蛋白變得不足W在溶液中保持水合，導致祀蛋白的沉淀。然而，通過鹽析程序獲得的沉淀 物常常難W重新溶解。因此，需要發現允許容易且溫和地重新溶解同時保持VWF的結構完整 性和生物活性的VWF沉淀方法。
[0013] 此外，常常作為共同沉淀來進行沉淀，其中沉淀劑還與目標蛋白一起沉淀。根據沉 淀劑的性質，隨后必須從沉淀劑中純化出祀蛋白，使得祀蛋白不受沉淀劑的污染。有力的沉 淀劑，如合成的聚電解質，非常難W從祀蛋白中除去和釋放或從祀蛋白中除去和釋放非常 緩慢。
[0014] 現有技術巧P1405863)中還已經描述了使用甘氨酸和氯化鋼的組合物沉淀vWF。然 而，需要大量的鹽并且難W避免不合需要的除了祀蛋白外來自溶液的其他組分的沉淀。如 果例如VWF溶液含有表面活性劑，如Pluronic酸，其通常用于細胞培養基中，EP1405863中所 述的沉淀條件可能導致P Iuroni C酸的共同沉淀，其可能甚至包含祀蛋白的沉淀。
[0015] US 5，679，776公開了為了從與因子VIII絡合的VWF的溶液中除去凝血酶絡合物， 使用SOmM氯化領，通過沉淀凝血酶原絡合物，而不是VWF/因子VIII絡合物。令人驚訝地，現 在發現巧離子-其與領一樣是堿±金屬-與憐酸鹽離子可W用于高產率地沉淀VWF，然后在 溫和條件下使用巧絡合劑將沉淀物重新溶解，同時保持VWF的生物活性。
[0016] 發明描述
[0017] 本發明的目的是提供用于從水溶液中濃縮VWF的方法，包括下列步驟：
[0018] (a)通過給水溶液提供巧離子和憐酸鹽離子來沉淀VWF，
[0019] (b)將步驟(a)中形成的沉淀物與水溶液分離，
[0020] (C)借助包含巧絡合劑的水溶液將步驟(b)中分離的沉淀物重新溶解。
[0021] 發明詳述
[0022] 本發明設及用于從水溶液濃縮von VWF的方法，通過將所述水溶液與巧離子和憐 酸鹽離子接觸，導致VWF和憐酸巧沉淀。將包含VWF的沉淀物與水溶液分離，并且通過將包含 巧絡合劑的水溶液添加到沉淀物中，在保持VWF生物活性的溫和條件下重新溶解。
[0023] 在優選的實施方案中，本發明設及：
[0024] 用于從水溶液濃縮von Willebrand因子(VWF)的方法，
[00巧]包括下列步驟：
[00%] (a)通過給水溶液提供巧離子和憐酸鹽離子來沉淀VWF，
[0027] (b)將步驟(a)中形成的沉淀物與水溶液分離，
[00%] (C)借助包含巧絡合劑的水溶液將步驟(b)中分離的沉淀物重新溶解。
[0029] 在本發明的優選實施方案中，使用至少ImM直至低于IOmM之間的憐酸鹽離子濃度 和至少16mM的巧離子濃度。
[0030] 在本發明的其他優選實施方案中，使用至少IOmM的憐酸鹽離子濃度和至少IOmM的 巧離子濃度。
[0031] 在優選實施方案中，憐酸鹽離子濃度為5mM，并且巧離子的濃度選自50mM至60mM的 范圍，包括該范圍的端點。
[0032] 可W結合某些巧離子濃度使用某些憐酸鹽濃度的多個組合。例如并且在不限制本 發明的情況下，可W使用W下的濃度組合：
[0033] ImM/L憐酸鹽離子可W結合16mM/L巧離子。
[0034] 2mM/L憐酸鹽離子可W結合16mM/L巧離子。
[0035] 3mM/L憐酸鹽離子可W結合16mM/L巧離子。
[0036] 4mM/L憐酸鹽離子可W結合16mM/L巧離子。
[0037] 5mM/L憐酸鹽離子可W結合16mM/L巧離子。
[003引 6mM/L憐酸鹽離子可W結合16mM/L巧離子。
[0039] 7mM/L憐酸鹽離子可W結合16mM/L巧離子。
[0040] 8mM/L憐酸鹽離子可W結合16mM/L巧離子。
[0041 ] 9mM/L憐酸鹽離子可W結合16mM/L巧離子。
[0042] 9.5mM/L憐酸鹽離子可W結合16mM/L巧離子。
[0043] 9.9mM/L憐酸鹽離子可W結合16mM/L巧離子。
[0044] 或
[0045] ImM/L憐酸鹽離子可W結合20mM/L巧離子。
[0046] 2mM/L憐酸鹽離子可W結合20mM/L巧離子。
[0047] 3mM/L憐酸鹽離子可W結合20mM/L巧離子。
[004引 4mM/L憐酸鹽離子可W結合20mM/L巧離子。
[0049] 5mM/L憐酸鹽離子可W結合20mM/L巧離子。
[0050] 6mM/L憐酸鹽離子可W結合20mM/L巧離子。
[0051 ] 7mM/L憐酸鹽離子可W結合20mM/L巧離子。
[0052] 8mM/L憐酸鹽離子可W結合20mM/L巧離子。
[0053] 9mM/L憐酸鹽離子可W結合20mM/L巧離子。
[0054] 9.5mM/L憐酸鹽離子可W結合20mM/L巧離子。
[0055] 9.9mM/L憐酸鹽離子可W結合20mM/L巧離子。
[0化6] 或
[0057] ImM/L憐酸鹽離子可W結合30mM/L巧離子。
[005引 2mM/L憐酸鹽離子可W結合30mM/L巧離子。
[0059] 3mM/L憐酸鹽離子可W結合30mM/L巧離子。
[0060] 4mM/L憐酸鹽離子可W結合30mM/L巧離子。
[0061 ] 5mM/L憐酸鹽離子可W結合30mM/L巧離子。
[0062] 6mM/L憐酸鹽離子可W結合30mM/L巧離子。
[0063] 7mM/L憐酸鹽離子可W結合30mM/L巧離子。
[0064] 8mM/L憐酸鹽離子可W結合30mM/L巧離子。
[0065] 9mM/L憐酸鹽離子可W結合30mM/L巧離子。
[0066] 9.5mM/L憐酸鹽離子可W結合30mM/L巧離子。
[0067] 9.9mM/L憐酸鹽離子可W結合30mM/L巧離子。 [006引 或
[0069] ImM/L憐酸鹽離子可W結合40mM/L巧離子。
[0070] 2mM/L憐酸鹽離子可W結合40mM/L巧離子。 [0071 ] 3mM/L憐酸鹽離子可W結合40mM/L巧離子。
[0072] 4mM/L憐酸鹽離子可W結合40mM/L巧離子。
[0073] 5mM/L憐酸鹽離子可W結合40mM/L巧離子。
[0074] 6mM/L憐酸鹽離子可W結合40mM/L巧離子。
[0075] 7mM/L憐酸鹽離子可W結合40mM/L巧離子。
[0076] 8mM/L憐酸鹽離子可W結合40mM/L巧離子。
[0077] 9mM/L憐酸鹽離子可W結合40mM/L巧離子。 [007引 9.5mM/L憐酸鹽離子可W結合40mM/L巧離子。
[0079] 9.9mM/L憐酸鹽離子可W結合40mM/L巧離子。
[0080] 或
[0081 ] ImM/L憐酸鹽離子可W結合50mM/L巧離子。
[0082] 2mM/L憐酸鹽離子可W結合50mM/L巧離子。
[0083] 3mM/L憐酸鹽離子可W結合50mM/L巧離子。
[0084] 4mM/L憐酸鹽離子可W結合50mM/L巧離子。
[0085] 5mM/L憐酸鹽離子可W結合50mM/L巧離子。
[0086] 6mM/L憐酸鹽離子可W結合50mM/L巧離子。
[0087] 7mM/L憐酸鹽離子可W結合50mM/L巧離子。
[0088] 8mM/L憐酸鹽離子可W結合50mM/L巧離子。
[0089