一種基于肽核酸探針的酪蛋白激酶-1基因突變檢測試劑及應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及分子生物學及臨床分子診斷技術領域，特別是設及一種基于膚核酸探 針的酪蛋白激酶-I(CKl)基因突變檢測試劑、PCR檢測方法及應用。
【背景技術】
[0002] Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高 度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發育、器官形成、組織再生和其它生理過程 中，具有至關重要的作用。如果運條信號通路中的關鍵蛋白發生突變或者異常表達，導致信 號異常活化，就可能誘導癌癥的發生。Wnt信號通路包括經典的Wnt信號通路與非經典的Wnt 信號通路，在經典通路即Wnt-0-catenin信號通路中，Wnt因子通過激活細胞膜上的 F;rizzle/LRP5/6協同受體后抑制細胞內游離0-catenin蛋白的憐酸化和降解，細胞質中的 0-catenin蛋白水平升高后將發生0-catenin蛋白的核移位，導致細胞核中0-catenin蛋白 升高，胞核中e-catenin蛋白能夠聯合巧go2、Bd-9W及化xMl蛋白共同與TCF/LEF-1轉錄因 子家族形成復合體并激活Wnt信號通路下游祀基因的轉錄激活。
[0003] CKl蛋白是Wnt信號通路中0-catenin上游重要成員之一。其主要作用是能夠與 Axin2、GSK30、APC等蛋白結合形成復合體，促進細胞質中0-catenin的降解。目前越來越多 的研究已經發現，在很多腫瘤中CKl蛋白均呈現不同程度的突變。
[0004] 目前研究核屯、信號通路的核屯、分子調控機制，W及某些重要成員在細胞中的表達 水平，已經成為治療腫瘤的一種關鍵手段，近年來Wnt信號通路在癌癥中的研究，W及CKl蛋 白作為Wnt信號通路重要成員其突變水平的研究，已經成為研究開發腫瘤藥物急需解決的 重要問題，尤其是在CKl基因激酶結構域中發生的突變，對CKl蛋白發揮功能起著非常重要 的作用，例如在睪丸生殖細胞癌細胞中檢測出G72DS突變，肝癌細胞中檢測出FlOlL突變等。
[0005] 膚核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一類W多膚骨架取代糖憐酸主鏈的DNA 類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎上，通過計算機設計構建并最終人工合成的 第S代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即W中性的膚鏈酷胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代 了DNA中的戊糖憐酸二醋鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可W通過Watson-化ick堿基配對的 形式識別并結合DNA或RNA序列，形成穩定的雙螺旋結構。由于PNA不帶負電荷，與DNA和RNA 之間不存在靜電斥力，因而結合的穩定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的 雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠 優于DNA/DNA或DNA/RNA，表現在很高的雜交穩定性、優良的特異序列識別能力、不被核酸酶 和蛋白酶水解。
[0006] 本方法采用特異序列的PNA寡聚物作為探針。由于PNA是一種人工合成的核酸的類 似物，并且為非手性、不帶電荷的分子，避免了寡核巧酸與其祀基因結合時因電荷相互排斥 所導致的雜交不穩定性，結合不易受雜交液離子強度的影響，從而顯示出極強的雜交優勢， 大大提高了檢測靈敏度。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是針對現有技術中如何確定Wnt信號通路中核屯、的信號分子CKl基 因突變情況，W及如何解釋核屯、分子CKl在腫瘤細胞中的突變水平變化的困難，提供了一種 檢巧UWnt信號通路中CKl基因突變檢測試劑、PCR檢測方法及應用。
[0008] 本發明的目的是提供一種用于酪蛋白激酶-I(CKl)基因突變檢測的試劑，包括用 于阻斷野生型CKl基因擴增的野生型PNA序列、用于特異性擴增G72D、F101L突變型CKl基因 序列的一組引物對及突變型PM巧光探針：
[0009] 所述檢測CKl基因G72D突變正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1;
[0010] 所述檢測CKl基因G72D突變反向引物如序列表中沈Q ID NO.2;
[0011] 所述檢測CKl基因FlOlL突變正向引物如序列表中SEQ ID NO.3;
[0012] 所述檢測CKl基因FlOlL突變反向引物如序列表中SEQ ID NO.4;
[0013] 所述檢測CKl基因G72D突變PNA巧光探針如序列表中SEQ ID NO.5;
[0014] 所述檢測CKl基因FlOlL突變PNA巧光探針如序列表中SEQ ID NO.6;
[0015] 所述特異性結合包含CKl基因72密碼子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.7。
[0016] 所述特異性結合包含CKl基因101密碼子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.8。 [0017] 修飾所述5'端的所述巧光報告基團為:FAM、皿乂^61\1〇6、￥1(：、1?0乂、切3或切5，修 飾所述3'端的澤滅基團為:14134、6(311986、8冊1、8冊2、8冊3或048(：化。
[0018] 本發明所述的檢測試劑還包括PCR反應液、72密碼子和101密碼子突變型參考品、 72密碼子和101密碼子野生型參考品，其中PCR反應液包括:DEPC水、具有5 ' 一3 '外切活性的 DNA聚合酶、dNTPs、10XPCR Buffer、RNASIN、M-MLV逆轉錄酶、oligo(dT)和含Mg離子的溶 液。
[0019] 所述72密碼子突變型參考品為含SEQ NO.9的重組質粒DNA;
[0020] 所述72密碼子野生型參考品為含SEQ NO. 10的重組質粒DNA;
[0021] 所述101密碼子突變型參考品為含SEQ NO. 11的重組質粒DNA;
[0022] 所述101密碼子野生型參考品為含SEQ NO. 12的重組質粒DNA;
[0023] 所述具有5 ' 一3 '外切活性的DNA聚合酶為化q酶；
[0024] 所述PCR反應液各組分在PCR擴增反應體系中的終濃度為：Taq酶0.0 lU/iil~ 0.05U/山，dNTPs 0.2~0.6mM，10XPCR Buffer 1X，RNASIN 40UAU~60U/山，M-MLV逆轉 錄酶20011/41~3201]/41，]\%(：12 1.5~5.01111，溶劑為肥?(：水。
[0025] 具體地，所述正向引物的終濃度為0.05~0.9測，所述反向引物的終濃度為0.05~ 0.9咖，所述oligo(dT)終濃度為0.05~0.9測，所述互補PNA序列終濃度為0.05~0.9咖，所 述巧光探針的終濃度為0.05~0.9iiM。
[0026] 本發明所述的試劑進行實時巧光定量PCR的反應程序為:42°C逆轉錄20min;94°C 預變性，2min; 95 °C變性，30s，58 °C，45s川欠集巧光），進行40個循環。
[0027] 本發明的原理是通過構建與CKl基因野生型互補的一段膚核酸PNA序列，當膚核酸 PNA序列與CKl基因互補結合時，任一突變均可導致PNA/DNA產生錯配，從而使得溶解溫度發 生改變。進而根據CKl基因突變型設計特異性的膚核酸PNA探針W及引物對CKl突變型基因 進行巧光定量PCR擴增，經過一輪的PCR擴增后，即可將CKl基因突變型與野生型進行區分開 來。
[0028] 進一步地，本發明還提供了所述的試劑在制備檢測癌細胞的檢測試劑中的應用， 所述癌細胞為睪丸生殖細胞癌、肝癌。
[0029] 與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是：CKl基因是Wnt信號通路中0-catenin蛋白上游發揮著重要功能的基因，本發明提供了直接檢測Wnt信號通路中CKl基因 突變檢測的試劑，借助于所述檢測試劑能夠通過實時巧光定量PCR法在轉錄水平快速檢測 出CKl基因的突變，而與普通實時巧光定量PCR不同的是，本發明設計野生型PNA序列，可有 效抑制野生型基因組擴增，只富集突變型基因擴增，大大提高了檢測特異性，我們使用的膚 核酸PM巧光探針更加靈敏，本發明為抗癌藥物的篩選，新祀向藥物的機制研究都提供了非 常有力的工具。
[0030] 同時本發明的實驗體系可W在任何一臺實時巧光定量PCR儀器上進行，上述引物 置于八聯管中，進行實時巧光定量PCR檢測，實驗操作簡單，費用低廉，結果重復性，敏感性 好，是研究腫瘤相關藥物作用機理及基礎科學研究的一種重要手段。
【附圖說明】
[0031 ]圖1是本發明實施例中所述膚核酸質譜圖；
[0032] 圖2是樣本、G72D突變型和野生型參考品PCR擴增圖；
[0033] 圖3是樣本、FlOlL突變型和野生型參考品PCR擴增圖；
【具體實施方式】
[0034] 通過W下詳細說明結合附圖可W進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施 例僅是對本發明方法的說明，而不W任何方式限制本發明掲示的其余內容。
[0035] 本發明通過肝癌細胞進行舉例說明，但是本發明不局限于肝癌細胞，本發明所述 檢測試劑還可W應用于睪丸生殖細胞癌。
[0036] 實施例中的有關DNA和RNA基本操作均參考《分子克隆：實驗室操作指南》(金冬雁 等譯，科學出版社，北京（1998))和《精編分子生物學指南》（顏子譯，科學出版社，北京 (1998))。
[0037] 本發明中化pG2 (人肝癌化pG2細胞系）購自美國ATCC，培養細胞所使用的RPMI-1640培養基及10%胎牛血清均購自英俊公司，其他試劑主要購自寶生物工程(大連)有限公 司。
[0038] 【實施例1】引物探針設計
[0039] 根據美國國家生物技術信息中屯、（National Center for Biotechnology Inf ormat ion，NCBI) (http : //www .ncbi.nlm.nih. gov)報道的CKlmRNA序列（NCBI Reference Sequence :NM_001025105.2)，使用Applied Biosysterns公司開發的Primer Express Software for Real-Time PCR軟件設計特異的CKl引物與探針。
[0040] CK1G72D：
[0041 ] CKl-F:5 '-CCAGTTGCTGTACGAGAGCAAG-3 '；（SEQ NO.1)
[0042] CK1-R:5 '-GCACATATTCAATTCTACTGATCATCTG-3 '；（SEQ NO.2)
[0043] 突變型〇(1。臟）斗：5,施-6661764〔41'〔0：-8冊3'；（沈9^.5)
[0044] 野生型CKl-PNA:5'-GGGTTGGCATCCC-3'（沈Q N0.7)
[0045] 突變型祀序列：
[0046]
[0047] 野生型祀序列： r00481
[0049] CK1F101L:
[00加 ]CK1-F:5，-CCAGTTGCTGTACGAGAGCAAG-3，；（SEQ NO.3)
[0051 ] CKl-R:5，-GCACATATTCAATTCTACTGATCATCTG-3，；（SEQ NO.4)
[0052]突變型〇(1。臟）斗：5,施-〔644640：1'(：176441'1'1'-8冊3'；（沈9^.6)
[0053]野生型CK1-PNA:CGAAGACCTCTTCAATTT;(SEQ N0.8)
[0化4] 突變型祀序列： 「mwl
[0化6] 野生型祀序列：
[0化7]
[0化引 W上:F:forward，正向；CKl-F表示用于檢測核酸的正向引物。
[0化9] R:reverse，反向；CKl-R表示用于檢測核酸的反向引物。
[0060] P:probe，巧光探針;CKl-P表示用于檢測核酸的巧光探針，該巧光探針為化qMan巧 光探針。
[0061 ]在本發明實施例中，修飾巧光探針的5 '端的巧光報告基團