一種快速檢測副雞禽桿菌的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及試劑盒檢測技術領域，具體的說設及一種快速檢測副雞禽桿菌的試劑 盒。
【背景技術】
[0002] 副雞禽桿菌是細小的革蘭氏陰性菌，細菌長約1-3皿，寬0.4-0.8皿，無鞭毛，不形 成芽抱，毒力菌株往往有芙膜。副雞禽桿菌培養條件較為苛刻，需要在培養基中加入MD，但 在南非也發現NAD非依賴性分離株，說明NAD不是必需的營養成分。該菌兼性厭氧，在固體培 養基上培養時需厭氧環境或3%-10%的C〇2。基于血凝抑制試驗建立起來化ge方法將副雞 禽桿菌分為A、B、CS種血清型。副雞禽桿菌引起的疾病叫做雞傳染性鼻炎。病雞精神委頓， 垂頭縮頸，食欲明顯降低。最初自鼻孔流出水樣汁液，繼而轉為漿性黏性分泌物，雞只有時 甩頭，打噴曖，眼結膜發炎，眼險腫脹，有的流淚，一側或兩則顏面腫脹，部分病雞可見下頌 部或肉養水腫。該病潛伏期短，傳播迅速，短時間內便可波及全群。育成雞表現為生長不良， 產蛋雞產蛋量明顯下降，處在產蛋高峰期的雞群產蛋量大幅度下降10%-40%，有時高達 70 %至完全停產。混合感染時可引起病雞死亡，給養殖業造成了重大的損失。
[0003] 目前進行細菌分類鑒定中常用的祀基因是16S rRNA，它是細菌染色體上編碼rRNA 相對應的DNA序列，具有高度的保守性，16s rRNA基因檢測技術已成為病原菌檢測和鑒定的 一種強有力工具。副雞禽桿菌的生化反應復雜，不同毒力的菌株會有不同的結果；間接血凝 試驗雖是目前最準確有效的方法，但此方法用時較長;PCR檢測方法雖然特異性強，但是需 要的PCR擴增儀十分昂貴。因此，發明一種操作簡便、準確快速的檢測副雞禽桿菌的方法對 雞傳染性鼻炎預防和治療具有重要意義。
[0004] 環介導等溫擴增基因技術（loop-mediated isothermal amplication,簡稱LAMP) (國際專利公開號WOOO/28082)是2000年Notomi等開發出的一種核酸擴增新技術，其特點是 針對祀基因的6個區域設計4種特異引物，利用鏈置換型DNA聚合酶，能在等溫條件下(60~ 65°C )，化內特異地擴增出IO9-IOiD拷貝祀序列，擴增結果可直接對擴增副產物焦憐酸儀沉 淀通過肉眼進行判斷或檢測其濁度，也可用結合雙鏈的巧光染料優選SYBR Green I染色， 即可通過肉眼判定。在保持傳統PCR技術優點的基礎上，進一步提高了反應的特異性，同時 縮短了檢測時間。國內外在病原體的檢測方法，利用LAMP方法對多種動物疫病和微生物檢 測已有很多報告。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度和精確度、操作簡 便的檢測副雞禽桿菌的試劑盒及其檢測方法。
[0006] 首先，本發明的第一個技術目的是提供一種高靈敏度、高特異性的用于檢測副雞 禽桿菌的LAMP引物組，包括:外引物F3和B3，內引物FIP和BIP，所述的外引物F3和B3的核巧 酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示，所述的內引物FIP和BIP的核巧酸序列如SEQ ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0007]在此基礎上，本發明進一步提供一種簡單、快速、準確的檢測副雞禽桿菌的試劑 盒，該試劑盒具有靈敏度高、特異性強、操作簡單的特點。
[000引所述試劑盒為LAMP試劑盒，除了包含上述引物組外，還包括:LAMP緩沖液、BstDNA 聚合酶、dNTPs、無菌去離子水、陽性對照和陰性對照。如果采用巧光目視法時，還包括巧光 染料。
[0009] 優選的，本發明的試劑盒中LAMP引物組的濃度為:外引物F3和B3的濃度為SpmolAi L內引物FIP和BIP的濃度為40pmolAiL。
[0010] 更為優選的，本發明的試劑盒包括：
[00川 1H0XLAMP緩沖液；2)8000U/mL BstDNA聚合酶；3)10mM dNTPs;4)LAMP引物組；5) 無菌去離子水;6)巧光染料：10 X SYBR GreenI; 7)陽性對照：0083、022和Modesto副雞禽桿 菌基因組DNA;陰性對照:無菌去離子水。
[0012] 其中所述的10XLAMP緩沖液含有25°C下抑8.8的200mM Tris-HCiaoomM氯化鐘、 IOOmM硫酸錠、20mM硫酸儀、8M甜菜堿和體積百分濃度為1 %的曲拉通X-100。
[0013] 更進一步的，本發明提供一種采用上述的試劑盒快速檢測副雞禽桿菌的方法。其 中反應體系優選為：每25化反應液中，引物組的引物用量為各IiiUBstDNA聚合酶1化， lOmmol/L的dNTPs3.扣L，待檢樣品DNA2~化L，無菌去離子水適量;反應條件為:65°C恒溫反 應60min，并在80°C持續lOmin。其中待檢樣品基因組DNA按常規方法提取或試劑盒提取。
[0014] 當試劑盒采用巧光目視法時，反應體系中還包括10XSYBR Green I 2.化L，反應 體系總量保持25.0化不變。
[0015] 本發明試劑盒反應完成后肉眼觀察液體變混濁(如果加入巧光染料則顏色由澄色 變為綠色），則說明樣品中含有副雞禽桿菌;或使用2%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性則可 呈現典型的特異梯狀條帶，陰性則無此現象。
[0016] 本發明的試劑盒W及檢測方法具有W下優點：
[0017] 1)快速高效:整個擴增過程僅需35~50min，擴增產量可達IO9-IQi日個拷貝祀序列；
[0018] 2)操作便捷:不需要復雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變 性等繁瑣步驟，只需要普通水浴鍋即可進行檢巧
[0019] 3)特異性強:本發明根據副雞禽桿菌16s DNA序列設計4條特異性引物，應用上述 引物，擴增祀序列的4個區域，4個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其 特異性極高，且非常穩定，形成引物二聚體概率低，確保反應的順利進行；
[0020] 4)靈敏度高:最低檢測極限可達到0.5~0.化g/管，比普通PCR高1-2個數量級；
[0021] 5)適合現場檢測：肉眼觀察液體變渾濁即為陽性，澄清透明則為陰性;若采用巧光 目視法觀察顏色變化，顏色變為綠色為陽性，澄色為陰性;或使用2%濃度瓊脂糖凝膠電泳 檢測，陽性可呈現典型的特異梯狀條帶，陰性無此現象。
[0022] 本發明的LAMP檢測方法具有快速高效、操作簡便、特異性強、靈敏度高、適合現場 檢測等優點，不需要配置相關檢測儀器，為副雞禽桿菌的檢測提供了新的技術支撐，可用于 畜牧業生產單位、獸醫檢測實驗室、屠宰場、出入境和各疾病預防控制中屯、篩查和檢測，具 有廣闊的市場前景，適于推廣應用。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發明LAMP檢測方法的外引物與內引物比例優化試驗結果圖；M為DL-SOOOmarker，泳道號1-6分別為外、內引物比1: 5，1:6，1: 7，1: 8，1:9，1:10，泳道7為陰性對 照；
[0024] 圖2為本發明LAMP檢測方法的引物缺省試驗結果圖；M為化-SOOOmarker; 1-7分別 為內外引物全有;無上游外引物F3;無下游外引物B3;無上游內引物BIP;無下游內引物FIP; 無上、下游外引物F3、B3;無上、下游內引物FIB、BIP;泳道8為陰性對照；
[002引圖3為本發明LAMP檢測體系中不同濃度Mg2+試驗結果圖;1為0心5000111曰'1?5^ 1-6分 別為濃度SmM、6mM、7mM、SmM、9mM、1 OmM 的 MgS04; 7為陰性對照；
[0026] 圖4為本發明LAMP檢測體系中不同濃度Bst DNA聚合酶試驗結果圖；M為DL-SOOOmarker; 1-6分別對應BstDNA polymerase添加量依次為0.4化、0 .化L、0.如L、1.0化、 1.化L、l.化L;7為陰性對照；
[0027] 圖5為本發明LAMP檢測體系中不同濃度dNTPs試驗結果圖;]\C%Dk5000marker; 1-7 分別對應反應體系中的dNTPs的濃度依次為0.8mnK)L/L、1 .OmiroL/L、1.2mnK)L/L、1.4mnK)L/L、 1.6mmoL/L、1.8mmoL/L、2. OmmoL/L; 8為陰性對照；
[002引圖6為本發明LAMP檢測條件的不同反應溫度試驗結果圖；M為化-5000marker; 1-7 分別對應溫度梯度為61.0 °C、62.0 °C、63.0 °C、64.0 °C、65.0 °C、